Синтеза и репарация на ДНК

СИНТЕЗА И РЕПАРАЦИЯ НА ДНК

1. Синтеза на ДНК – репликация (удвояване)

1.1. Кратко общо описание на репликацията

         Самовъзпроизвеждането на живите същества се основава на възможността всеки добър запис на генетична информация, веднъж получен в един екземпляр, да се размножи в произволен "тираж". Това става чрез матрична синтеза на ДНК, наречена репликация или удвояване. Казваме, че даден биополимер се синтезира матрично, когато подредбата на мономерите му се определя не от ензим, а от подредбата на мономерите в друг, вече съществуващ биополимер (матрица).

         За да се осъществи репликация, е нужна ДНК-матрица и свободни дезоксирибонуклеотиди. Двете вериги на матрицата се разделят (как точно, ще обясним по-долу). Така полинуклеотидните вериги на ДНК стават достъпни за дезоксирибонуклеотидите, които плуват в околния разтвор. Движейки се хаотично чрез дифузия, свободният нуклеотид може да допре с базата си някоя база на ДНК. Ако двете бази се случат комплементарни, нуклеотидът ще остане на място, закрепен върху ДНК с водородни връзки. Важно е да се разбере, че тези водородни връзки се образуват спонтанно, без помощта на ензим или друг белтък. Най-деликатният момент от синтезата на ДНК – подборът на нуклеотидите за новата верига, се основава на комплементарността.

         За да се довърши синтезата на новите ДНК-вериги, остава присъединилите се свободни нуклеотиди да се свържат помежду си с фосфодиестерни връзки. Доколкото това е химична реакция, включваща разкъсване и образуване на ковалентни връзки, нужен е ензим. Той се нарича ДНК-зависима ДНК-полимераза, за по-кратко само ДНК-полимераза.

         След като ДНК-полимеразата свърши работата си, на мястото на старата молекула ДНК ще има две нови. Всяка от новите двойни спирали ще има 1 нова и 1 стара верига. Затова казваме, че репликацията е полуконсервативна.

1.2. Репликацията от химична гледна точка

         Дезоксирибонуклеотидите, които служат като субстрат за синтезата на ДНК, са предварително фосфорилирани до трифосфати. От трите остатъка фосфорна киселина обаче само един ще се включи в ДНК-веригата. Другите два ще се отделят като пирофосфат Ф–Ф (на фигурата означен на латиница, Р–Р):

         Възниква въпросът защо реакцията е така усложнена. Отговорът е: за да тече в нужната посока. Ако свободните нуклеотиди бяха монофосфати, свързването им в ДНК-верига би изисквало отделяне на вода, а реакциите с отделяне на вода са крайно неизгодни във водна среда. Ако се използваха дифосфати, би се отделила фосфорна киселина – по-добре, но все пак недостатъчно добре. При използването на трифосфати се отделя пирофосфат, който после се хидролизира до две молекули фосфорна киселина (това не е показано на фигурата). Знае се, че отстраняването на някой от продуктите е отличен начин да се насочи химичната реакция накъдето трябва. Енергетичната цена е висока, но клетката не пести при процеси, от които зависи животът й.

         Ензимът ДНК-полимераза може да присъедини нов нуклеотид само към свободен 3'-край. Затова новата верига расте в посока от 5' към 3', а матрицата се чете в посока от 3' към 5'.

1.3. Подробно описание на репликацията и участващите в нея молекули

         Всяка матрична синтеза на биополимер има три етапа – инициация (започване), елонгация (удължаване) и терминация (завършване). Най-трудно е започването. Репликацията на ДНК винаги започва от определен участък, наречен начало. Първичната му структура се разпознава от определени белтъци, на които няма да се спираме. Тези белтъци настаняват върху ДНК първия важен белтък-участник в репликацията, който ще назовем по име: хеликазата.

         Функцията на хеликазата е да раздели комплементарните вериги на ДНК, за да могат те да служат като матрици. След като разкъса водородните връзки в областта на началото, хеликазата започва да пълзи по ДНК като машинка на цип, оставяйки след себе си разделени вериги. Енергия за работата си получава от АТФ.

         След като хеликазата извади на показ матриците, може да започне синтезата на новите вериги. Тук обаче възниква едно усложнение. При репликацията е нужна много голяма точност, защото всяка грешка може да обрече едната дъщерна клетка. Затова ДНК-полимеразата има т. нар. редакторска активност – винаги "оглежда" последния присъединен към веригата нуклеотид. Ако по погрешка е свързан некомплементарен нуклеотид, той леко ще стърчи навън. Ензимът усеща това, спира на място и изрязва погрешния мономер. Но когато синтезата започва, първите няколко нуклеотида не изглеждат безупречни, дори и да са. С навика си вечно да поглежда назад ДНК-полимеразата може само да удължава и е неспособна да започне нова верига.

         Проблемът е заобиколен, като първо друг ензим синтезира къса верига РНК (обикновено десетина нуклеотида), а после ДНК-полимеразата я продължава с дезоксирибонуклеотиди. Късата верига се означава като зародиш или праймер (от англ. prime – зареждам, подготвям за работа). Ензимът, който я синтезира, се нарича праймаза.

         След като се синтезира праймерът, ДНК-полимеразата може да продължи. Мястото, където се синтезира ДНК, има Y-образна форма и затова се нарича репликационна вилка. ДНК-полимеразата, хеликазата и другите белтъци, действащи там, не са означени на долната рисунка.

         На схемата освен това тактично е пропусната втората дъщерна верига. Изглежда, че тя би трябвало да напредва в посока 3' – 5'. ДНК-полимеразата обаче синтезира само в посока 5' – 3'. Как тогава репликацията би могла да обхване и двете матрични ДНК-вериги в цялата им дължина? Доколкото няма ензим, способен да наслагва нуклеотиди в посока 3' – 5', и двете вериги се изграждат в посока 5' – 3'. Докато обаче едната се удължава плавно, другата се синтезира във вид са отделни парчета, които започват от репликационната вилка и продължават назад. Те се наричат фрагменти на Оказаки по името на откривателя си и са сравнително къси (при бактериите 1000-2000 нуклеотида). Дъщерната верига, която напредва непрекъснато в посока към вилката, се нарича водеща, а тази, която се изгражда от фрагменти на Оказаки – изоставаща.

         На схемата е дадена синтезата на изоставащата верига (долната). Периодично от репликационната вилка назад се синтезират праймери. ДНК-полимеразата ги удължава, докато опре в 5’-края на предишния праймер. Той отдавна е изиграл ролята си и се отстранява от ензим – нуклеаза. Празното му място се запълва с дезоксирибонуклеотиди от ДНК-полимераза, която удължава съседния ДНК-участък. Така се стига до два допрени фрагмента ДНК. Трябва им само една фосфодиестерна връзка, за да се слеят. Тя се образува от ензим, наречен ДНК-лигаза (от лат. ligo – свързвам). Така изоставащата верига се удължава на тласъци в посока 3' – 5', макар че отделните фрагменти на Оказаки се синтезират в единствено разрешената посока 5' – 3'.

         На горната схема не бяха означени белтъците-участници в репликацията. Ето репликационна вилка с белтъци:

         ДНК-полимеразата на водещата верига наистина следва плътно хеликазата, както е нарисувано, и дори е свързана с нея физически чрез слаби връзки.

         Досега разглеждахме само малък участък от удвояващата се ДНК, включващ една репликационна вилка. Следващата схема дава по-панорамен, "птичи" поглед на реплициращи се молекули ДНК – пръстенна и линейна. Строго погледнато, има няколко типа репликация, но тук ще разгледаме само най-разпространения – т. нар. тип око или мехурче, наречен още тета-репликация. И трите имена са свързани с вида на реплициращата се ДНК. Вижда се, че докато репликацията напредва, структурата наистина напомня уголемяващо се око или мехурче. Пръстенните ДНК освен това наподобяват гръцката буква тета.

         В еукариотното ядро сложният строеж на хроматина затруднява репликацията. Всеки ДНК-участък, който се реплицира, трябва първо да се разопакова (декондензира). За целта свързаните с ДНК белтъци, най-вече хистони, се отделят. След като репликационната вилка отмине, удвоената ДНК наново се опакова с белтъци. Поради разхлабването на опаковката хетерохроматинът, когато се реплицира, заприличва на еухроматин.

1.4. Проблемът с краищата на линейната ДНК

         За репликацията е важно дали ДНК-молекулата е пръстенна или линейна. Прокариотните молекули ДНК са пръстенни, докато сред еукариотите линейната ДНК е по-популярна. Пръстенните молекули се реплицират цялостно без усложнения. При линейната ДНК обаче 5’-крайните части създават проблем. В хода на синтезата те се падат в началото. Дори ако праймазата е способна да започва от самия 5’-край, при репликацията ще се получат молекули, по-къси от изходната. Причината е, че крайният праймер след разграждането си не може да бъде заменен с ДНК. Очевидно са нужни мерки, за да не се стопи молекулата след няколко репликации.

         Запазването на дължината на еукариотните хромозоми се основава на техните теломери. Както знаем, теломерните последователности са многократни повторения на къс олигонуклеотид. След репликацията липсва един "екземпляр" на този олигонуклеотид, отговарящ на един праймер. Липсващото парче впоследствие се добавя от специален ензим – теломераза. Той съдържа като кофактор РНК-верига и може да синтезира единичната теломерна последователност без матрица. Сега става ясно защо теломерите се състоят от много къса (5-6 нуклеотида) повторена последователност. По-дълъг олигонуклеотид би затруднил ензима.

         Количеството на ензима теломераза е един от начините да се контролират деленията в многоклетъчния организъм. Отдавна е известно, че след изваждане от организма бозайниковите клетки се делят 30-50 пъти, след което престават да се делят. Изследванията на хромозомите на тези клетки показват, че теломерите им се скъсяват с течение на времето. Когато от теломерите остане малко, клетката вече не може да навлезе в следваща митоза. Такава клетка се нарича остаряла.

         Клетките от половия път съдържат теломераза, докато нормалните соматични клетки не я притежават в откриваемо количество. На много малко соматични клетки би се наложило да се делят толкова пъти, че да изчерпят теломерите си. Липсата на теломераза позволява на клетката да се раздели няколко пъти и същевременно я предпазва от изкушението да се дели неограничено. За съжаление раковите клетки преодоляват този контролен механизъм. Те "се научават" да активират теломеразния ген и в тях ензимът се открива. Затова раковите клетки се делят в култура неограничено време.

2. Репарация (поправка) на ДНК

2.1. Повреди, мутации и репарация

         Всеки органичен полимер с времето старее – губи свойствата си поради натрупани химични промени. Повредените белтъци и РНК се разграждат. Не е проблем да се произведат нови техни молекули, като се използва записът в ДНК. Но какво да се прави, ако нещо стане със самата ДНК? Явно ДНК не трябва да се поврежда, а ако все пак се повреди, трябва да се поправи.

         Повреда наричаме всяка промяна, която отклонява ДНК от обичайната й структура. Основните типове повреди са следните:

Скъсване на фосфодиестерния скелет, което може да засегне едната или и двете вериги.

Загуба на база.

Ковалентна модификация на база.

Въвличане на нуклеотид в неуместна ковалентна връзка с друг нуклеотид или друга молекула.

Поява на поначало нормална, но неподходяща база поради грешка при репликацията. В резултат се получава несдвояване – двойка срещуположни, но некомплементарни нуклеотиди или различен брой нуклеотиди в двете вериги.

         Повредите не трябва да се бъркат с мутациите, които също са химични промени в ДНК. Мутацията представлява подмяна на изходната ДНК-структура с друга, която също е допустима за ДНК. Мутиралият участък е ”като истински”: биологичната му функция може да е загубена, но от физична и химична гледна точка той е безупречен. Дори и леталните мутации, ако са рецесивни, могат да се предават в поколенията неограничено дълго. Следователно мутиралата ДНК най-малкото е стабилна и се реплицира нормално. Повредената ДНК, с изключение на повредите от тип несдвояване, дори не се реплицира нормално. Мутациите често са съвместими с живота, повредите – почти никога.

         Повредите настъпват много по-често, отколкото очакваме. ДНК на всяка човешка клетка губи около 5000 бази на денонощие. А загубата на база е само една от възможните повреди. Явно клетката не може да разчита на това, че нейната ДНК може и да не се поврежда. Нужно е възстановяване на нормалната структура на ДНК – процес, наречен поправка или репарация (от англ. repair, лат. reparatio – поправяне, възстановяване).

         Най-добре е, разбира се, след репарацията всичко да бъде както преди. Понякога обаче е невъзможно да се установи как точно е изглеждала ДНК преди повредата. Тогава на повредения участък се придава допустима структура, която може да е съществувала по-рано, но със същия успех може и да е нова. С други думи, мутациите нерядко са резултат от репарация на повреди. Системите за репарация обаче не са виновни. Повредената ДНК трябва да се поправи, дори с цената на мутация.

         Не е изненадващо, че всеки фактор, които поврежда ДНК, повишава честотата на определен тип мутации. Затова тези фактори се наричат мутагени. Съответно мутациите се делят на спонтанни и индуцирани според причините за възникването им. Индуцирани са мутациите, появили се под действието на определен мутаген. Спонтанните мутации се появяват без видима причина, макар че обикновено могат да се припишат на някой от обичайните фактори на средата – космически лъчи, ултравиолетови слънчеви лъчи, кислород, температура.

Репарацията се осъществява от ензими с помощта на регулаторни белтъци. Част от тези молекули непрекъснато обхождат двойната спирала и следят състоянието й. Когато бъде намерена повреда, тя се отстранява или от същия белтък, който я е открил, или от друг, присъединил се впоследствие към него ензим.

2.2. По-важни видове репарация

2.2.1. Репарация на скъсвания на фосфодиестерния скелет

         От всички повреди най-гладко се репарират едноверижните скъсвания на фосфодиестерния скелет. Те нормално се получават в хода на репликацията, така че клетката е свикнала с тях. Зашиват се от ензима ДНК-лигаза.

         Двуверижните скъсвания, т.е. когато в една точка от двойната спирала са разкъсани и двете ДНК-вериги, също се репарират с участието на ДНК-лигази. Този тип повреда обаче е сериозен и репарацията му е с несигурен изход, особено когато двуверижните скъсвания са две или повече. Има опасност парчетата да се съединят по нов начин и да се получат хромозомни мутации.

2.2.2. Репарация чрез изрязване (ексцизионна репарация)

         Най-честият и най-важният тип репарация е ексцизионната, т.е. “поправка чрез изрязване” (англ. excision, лат. excisio – изрязване). Тя се използва за повреди, засягащи само едната ДНК-верига. Повреденият участък се изрязва и после се възстановява, като се гледа от здравата верига.

         Повечето повреди са ограничени до една база. Най-честият тип, който беше споменат по-горе, е загубата на база поради спонтанното й откъсване от дезоксирибозата. Освен това базите могат да се променят вследствие на химични реакции.

         Други повреди засягат едновременно два или повече съседни нуклеотида. Например ако в ДНК-веригата два тимина стоят един до друг и клетката бъде осветена от ултравиолетови лъчи, двете тиминови бази могат да се свържат в димер. На долната схема е показана ексцизионна репарация на такъв тиминов димер.

         Първият етап, разбира се, е откриването на повредата. След това ензими-нуклеази срязват повредената верига от двете страни на засегнатия нуклеотид (или нуклеотиди). Отрязаното парче, съдържащо повредата, напуска двойната спирала. С получения свободен 3'-край се свързва ДНК-полимераза. Тя запълва с нови нуклеотиди празнината в пострадалата верига. На рисунката нуклеотидите, включени в ДНК при репарацията, са дадени по-светли от “старите” нуклеотиди. След работата на ДНК-полимеразата върху поправяната верига има скъсване, но иначе всички нуклеотиди са на мястото си. Скъсването се зашива от ДНК-лигаза и репарацията е завършена.

         При човека е известен наследствен дефект на ексцизионната репарация на тиминови димери. Той води до рецесивната болест пигментна ксеродерма (xeroderma pigmentosum). В откритите участъци на кожата се натрупват поражения, водещи до множество огнища на кожен рак и смъртен изход.

2.2.3. Рекомбинативна (пострепликативна) репарация

         След като ексцизионната репарация се основава на двуверижната структура на ДНК, лесно е да се разбере защо най-опасни са повредите по време на репликацията. Ако удвояването изпревари репарацията, репликационната вилка ще мине през повреден участък. Понеже дефектите не позволяват на ДНК-полимеразата да премине през тях, едната дъщерна молекула ДНК ще има повреда в старата верига и точно срещу нея – дупка в новосинтезираната верига

         В такива случай се задейства механизъм, наречен рекомбинативна или пострепликативна репарация. Използва се здравата дъщерна молекула ДНК. Част от едната й верига се взема, за да се запълни празнината в повредената молекула. Така пострадалата двойна спирала се сдобива с една здрава верига. Изходната повреда остава и трябва да се поправи по-късно чрез ексцизионна репарация. В неповредената молекула ДНК след участието й в спасителната операция ще се появи едноверижна празнина. Тя се запълва от ДНК-полимераза и ДНК-лигаза.

         Поради сложността си рекомбинативната репарация протича трудно и резултатът не е гарантиран. Понякога рекомбинацията не се извършва съвсем точно и води до хромозомна мутация. Все пак в повечето случаи процесът завършва успешно.

         Веднъж разработени, рекомбинациите са намерили и други приложения, например при половите процеси..

Основни източници

         Марков Г. Тайните на клетката. 3. осн. прераб. изд. Народна просвета, София, 1984.
         Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London, 1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
         Achenbach L. (1997). Lecture topic: DNA damage and repair. [Online] http://www.science.siu.edu/microbiology/micr460/460%20Pages/460.DNArepair.html
         Dale J.W. Molecular Genetics of Bacteria. 3^rd Edition. John Wiley & Sons, Inc., 1998.
         Kimball J.W. (2002). DNA Repair. [Online] http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNArepair.html

Copyright © Майя Маркова

Предишен раздел Начало Следващ раздел