ДНК. ЯДРО. ХРОМОЗОМИ И КАРИОТИП

1. Строеж на ДНК

         Дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК) е материалният носител на наследствената информация. Тя е полимер, съставен от дезоксирибонуклеотиди. Всеки дезоксирибонуклеотид е получен чрез свързване на фосфорна киселина, дезоксирибоза и азотна база. Остатъкът от фосфорната киселина на схемите обикновено се означава с Ф или (на латиница) Р. Дезоксирибозата е пентоза – монозахарид с 5 въглеродни атома. Азотната база е с пръстенна молекула и може да бъде аденин, тимин, цитозин или гуанин. Точни формули на нуклеотидите могат да се видят например на http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-2/ch10_nucleotidesb.jpg, но за целите на нашето разглеждане е достатъчна тази рисунка:

         Въглеродните атоми на пентозата е прието да се номерират с "прим", от 1' до 5' (само с числа без "прим" се означават атомите на азотната база). Азотната база се свързва на 1'-мястото, а фосфорната киселина – на 5'-мястото. Нарисуваният нуклеотид е монофосфат. Ако към остатъка от фосфорна киселина се присъедини втори, получава се дифосфат, а ако се добави и трети – трифосфат.

         ”Скелетът” на полинуклеотидната верига на ДНК е съставен от редуващи се дезоксирибозни и фосфатни остатъци. Казва се, че той се основава на 5’–3’ фосфодиестерни връзки, понеже 5’-мястото на всяка дезоксирибоза е свързано с 3’-мястото на следващата дезоксирибоза с фосфатна група. Съответно всяка линейна полинуклеотидна верига или част от нея има 5' и 3'-край.

         Броят, видът и най-вече подреждането на нуклеотидите в полинуклеотидната верига определя нейната последователност или първична структура. Прието е веригата да се разглежда и изписва в посока от 5’ към 3’-края. Макар и апериодично, подреждането на нуклеотидите в ДНК не е случайно. Именно чрез него е кодирана наследствената информация.

         За да може наследствената информация да се предава в поколенията, тя трябва да се копира точно. За всяко клетъчно делене са нужни нови молекули ДНК, еднакви със старите. Начинът на образуването им става ясен още с разгадаването на двойноспиралния строеж на ДНК през 1953. Молекулата на ДНК се състои не от една, а от две полинуклеотидни вериги. Те са застанали една срещу друга антипаралелно, така че 3'-краят на едната да е срещу 5'-края на другата. Двете вериги си взаимодействат чрез своите бази. Срещу всеки аденин от едната верига стои тимин от другата, а срещу всеки цитозин – гуанин. Това съответствие се нарича правило за комплементарност, а двойките бази А=Т и Ц=Г – комплементарни или допълнителни. Комплементарността се основава на пространствено сродство между аденина и тимина, от една страна, и цитозина и гуанина – от друга. Всяка двойка комплементарни бази се разпознават специфично и се свързват помежду си с водородни връзки. За това разпознаване и свързване не са нужни ензими или други спомагателни молекули. На фигурата водородните връзки са дадени в червено.

         Двойната верига на ДНК се завива спирално, защото тази форма е най-изгодна във водна среда. Тя позволява на азотните бази, които са доста хидрофобни, да се подредят една над друга във вътрешността на спиралата като карти във ветрило и да имат възможно най-малък допир с водата. Долната фигура показва двойната спирала на ДНК чрез стереодвойки. Погледнете зад образа, така че картината пред очите ви да се раздвои, и оставете средните две спирали (от получените общо 4) да се слеят в един тримерен образ.

ДНК, представена чрез стереодвойки. По Dickenson (1983) с малки изменения.

         След като обсъдихме накратко общия строеж на ДНК, ще разгледаме накратко в какъв вид се намира тя в клетката: колко са големи молекулите й, дали са пръстенни или линейни, къде се намират и с какви други структури са свързани. За прокариотите е достатъчно да кажем, че наследственият им материал (геномът) се състои от една голяма пръстенна молекула ДНК, наречена бактериална хромозома, и понякога допълнителни малки пръстенни молекули ДНК, наречени плазмиди. Бактериалната хромозома се разполага в средата на клетката и заетият от нея участък се нарича нуклеоид. Плазмидите се намират в цитоплазмата. Никоя от прокариотните молекули ДНК не е отделена с мембрана от другите съставки на клетката.

         При еукариотите нещата стоят далеч по-сложно и изискват по-подробен преглед.

2. Ядро и хроматин

         Почти целият наследствен материал (геном) на еукариотите е съсредоточен в ядрото, което е диагностичен белег на еукариотната клетка. "Почти"-то е заради малките пръстенни молекули ДНК, запазили се в органелите с ендосимбионтен произход – митохондриите и хлоропластите. По-долу ще разглеждаме само ядрената ДНК.

         На снимката долу се вижда ядро, наблюдавано с електронен микроскоп. Още при ранните микроскопски изследвания е станало ясно, че ядрото е изпълнено с добре багрещо се вещество. Нарекли са го хроматин. Той бива рехав – еухроматин (светлите участъци във вътрешността на ядрото), и плътен – хетерохроматин (тъмните места). Вижда се, че най-много хетерохроматин има под ядрената обвивка и около ядърцето.

Ядро от миша тимусна епителна клетка. Снимката е любезно предоставена от Цветана Маринова от катедра Биология на Медицинския университет – София.

         Снимки на ядрената обвивка под голямо увеличение могат да се видят на http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nuclear_envelope.htm. Тя е двойна – включва две успоредни ядрени мембрани (външна и вътрешна). На места се прекъсва от ядрени пори, където двете мембрани се съединяват и образуват тунел. Порите са доста широки и нагъсто разположени, затова ядрото не се различава от цитозола по състав на нискомолекулните вещества. Ядрената обвивка обаче спира или по-точно държи под контрол движението на макромолекулите. През порите преминават доста големи молекули и надмолекулни комплекси (например новоизградени рибозоми), но само в разрешената посока и момент. Освен това обвивката, колкото и пореста да е, защитава ДНК от механичните напрежения в цитоплазмата.

         Освен двете липидни мембрани ядрената обвивка поне при многоклетъчните животни включва и белтъчен слой. Той се нарича ядрена ламина, постила отвътре вътрешната ядрена мембрана и представлява плоска мрежа от нишки (за снимка вж. http://bio.winona.edu/bates/Bio241/images/figure-04-10-photo.jpg). Съставните белтъци на ламината се наричат ламини.

         Хроматинът е комплекс на ДНК с белтъци в приблизително равни тегловни части. Повече от половината белтъчна маса в хроматина се пада на няколко родствени белтъка, наречени хистони. Останалите белтъци на хроматина се наричат нехистонови.

         Ако хроматинът се подготви за електронно-микроскопско наблюдение в присъствие на прекалено малко соли, при силно увеличение се вижда нещо като наниз от мъниста. Такава снимка е показана например на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1621. "Мънистата" се наричат нуклеозоми (в превод "ядрени телца" от лат. nucleus – ядка, гр. сома – тяло). Те имат диаметър около 10 nm. Всяка нуклеозома се получава, като участък от ДНК се увие 2 пъти около белтъчен октамер, т.е. комплекс от 8 белтъчни молекули. Октамерът се състои от хистоните Н2А, Н2В, Н3 и Н4, всеки представен с по 2 молекули. Това може да се онагледи по следния начин:

         Цилиндърът е само най-грубо приближение за формата на октамера. По-точно негово изображение е този модел, основан на рентгеноструктурни данни.

Модел на нуклеозома – изглед отстрани. По Burlingame et al. (1985) с изменения.

         Хистоните, съставящи октамера, са много консервативни белтъци. Това значи, че хистоните на организми с далечно родство си приличат силно. Бавната еволюция е присъща на гени, свързани с най-основните жизнени процеси, които протичат в непроменен вид при големи групи организми.

         Между всеки две съседни нуклеозоми има участък от ДНК, който ги свързва, без да е намотан около никой от двата октамера. Тази ДНК се нарича линкерна (от link, англ. – свързвам). На снимките на “наниза от мъниста” линкерната ДНК се вижда като тънка нишка между нуклеозомите.

         От номерата на хистоните от октамера се подразбира, че някъде трябва да има и Н1. Такъв хистон наистина съществува. Той не изгражда нуклеозомата, а се присъединява към нея отвън, като се свързва с линкерния участък и "закопчава" ДНК в местата на влизане и излизане от нуклеозомата (начинът му на свързване може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1629). В еволюцията Н1 се променя повече от другите хистони, но сравнен с белтъците изобщо, и той е консервативен.

         Н1 сравнително лесно се откъсва от ДНК, когато в експериментални условия солевата концентрация се понижи. Тогава се получава "наниз от мъниста". Ако обаче хроматиновата нишка се подготвя за електронно-микроскопско наблюдение в присъствие на нормално количество соли, Н1 остава на мястото си и картината е друга. Получава се нишка с диаметър 30 nm (вж. отново http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1621). Строежът на 30-nm нишка още не е съвсем изяснен. Предполага се, че тя е плътна спирала (соленоид) с 6 нуклеозоми на оборот, както е показано на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1627. На свой ред 30-nm нишка образува сравнително дълги бримки (средна дължина около 60 килобази), чиито краища се държат съединени от нехистонови белтъци.

         Такава е опаковката на еухроматина през интерфазата. Тя е сравнително рехава и затова еухроматинът изглежда светъл. По време на митозата хромозомите се опаковат допълнително. Хетерохроматинът след края на митозата не се разопакова много, така че и през интерфазата е уплътнен приблизително колкото митотичния хроматин. Затова при микроскопско наблюдение той се вижда тъмен.

         Макар че висшите нива на опаковка на хроматина все още се изясняват, изглежда почти сигурно, че бримките на всяка хроматида се подреждат спирално около ос от нехистонови белтъци ("хромозомен скелет"). Оста се скъсява все повече, докато хромозомата се уплътни максимално през метафазата, след което отново започва разхлабване. Оста често се нарича хромозомен скелет. Модел за степените на опаковка на хроматина от гола ДНК до метафазна хромозома е даден на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=chromatin&rid=cell.figgrp.1655.

3. Хромозоми и кариотип

         Терминът "хромозома" се употребява в три значения. Първоначално той е въведен за нишките, наблюдавани през митозата и мейозата. По-късно става ясно, че хромозомите съответстват на интерфазния хроматин и са изградени от ДНК и белтъци. Тогава хромозоми са наречени нуклеопротеиновите единици на хроматина независимо дали са видими (при деленето) или са с размити очертания в интерфазното ядро. Оставало е да се изясни колко молекули ДНК има в една хромозома. Оказва се, че през по-голямата част от живота на клетката хромозомата се състои от 1 молекула ДНК, а при подготовката за делене те стават 2 – по една за всяка хроматида. В редки случаи след многократно удвояване на ДНК се получават хромозоми от повече нишки – явление, наречено политения (от гр. поли – много, тения – нишка). След тези данни молекулите ДНК започват също да се наричат хромозоми. Подтекстът определя дали под хромозома се има предвид молекула еукариотна ядрена ДНК, комплексът на тази молекула с белтъци или същият комплекс при условие, че е уплътнен за делене. Можем обаче да въведем и определение, валидно за всички еукариотни хромозоми и дори за бактериалните хромозоми. Хромозомата е част от наследствения материал на клетката, която, ако бъде преместена, се движи като цяло. С други думи, хромозомата е единица за сегрегация.

         Хромозомите обикновено се изучават в метафаза, защото тогава са най-уплътнени и добре разграничени. Всяка метафазна хромозома се състои от 2 хроматиди. Те са все още свързани в областта на центромерата – ДНК-участъка, с който се закачат за делителното вретено. Под микроскоп този участък се вижда стеснен и е наречен от ранните наблюдатели първично прищъпване.

         Центромерата разделя напречно всяка хромозома (съответно хроматида) на две части, наречени рамена. Според положението на центромерата, т.е. според относителната дължина на двете рамена, хромозомите се разделят на 3 групи: (1) метацентрични – с центромера по средата и еднакво дълги рамена; (2) субметацентрични – с донякъде изместена към единия край центромера; двете рамена са различно дълги, но все пак разликата не е твърде голяма; (3) акроцентрични – със силно изместена към единия край центромера, така че едното рамо е съвсем късо. За изчерпателност следва да споменем и телоцентричните хромозоми, които имат само едно рамо, защото центромерата е в самия им край. Истински телоцентрични хромозоми не се срещат в нормалния хромозомен набор, а са резултат от скъсване на някоя хромозома в центромерата или точно до нея. Някои автори обаче наричат “телоцентрични” хромозомите, които просто са силно акроцентрични.

         Тъй като ДНК в ядрото е линейна, през метафазата всяка хромозома има 4 свободни края. Крайните участъци на хромозомата се наричат теломери. Трябва да се отбележи, че линейни молекули ДНК не могат да се получат от пръстенни чрез просто разкъсване. Случайно получените краища са неустойчиви, склонни да се свързват както помежду си, така и с други молекули. Истинските теломери обаче са стабилни поради особената си първична структура.

         Някои хромозоми имат още едно прищъпване освен това на центромерата. В това вторично прищъпване са разположени гените за големите рибозомни РНК. Заетият от тях участък ДНК се нарича нуклеоларен (ядърцев) организатор, защото около тези участъци към края на митозата се образува ядърцето.

         Описанието на хромозомния набор на даден вид се нарича кариотип. От фигурата се вижда, че различните видове опаковат своята ДНК в различен брой хромозоми.

Метафази от клетки на: А – мишка Mus musculus, 2n = 40. Снимката е любезно предоставена от Петя Нинова от Института по молекулярна биология. Б – дива люцерна Medicago sativa ssp. coerulea, 2n = 16. От Bauchan (2003) с любезното му разрешение. В – папрат четинест многоредник Polyctichum setiferum, 2n = 82. Снимката е любезно предоставена от Даниела Иванова от Института по ботаника.

         Когато хромозомите са оцветени равномерно като на горните снимки, трудно е да се намират участъци по дължината им, а понякога дори не е ясно коя хромозома коя е. Затова са разработени методи за диференциално оцветяване, при което върху всяка хромозома се очертават характерни само за нея ивици. Тогава е лесно да се търсят области по хромозомата и няма опасност тя да се сбърка с нехомоложна хромозома, дори и ако размерите и формата им са еднакви. На долната фигура се виждат човешки хромозоми, оцветени по този начин, изрязани от микроскопската снимка и подредени според общоприети правила. Такава редица от хромозоми се нарича кариограма.

Кариограма на изследван пациент с нормален мъжки кариотип, любезно предоставена от Заряна Маркова от Генетичния център в Смиттаун, САЩ.

         Впрочем въпросът за мястото на гените в хромозомите по-рано е бил доста неудобен. С обикновените микроскопски методи в интерфазния хроматин не се виждат хромозоми. От друга страна, митотичната хромозома не се презаписва и е уплътнена до непроницаемост. Тя се вижда, но за нея е трудно да се каже нещо повече. Нещата са били улеснени от откриването на един особен тип хромозоми, които са много едри и съчетават добре видима форма с транскрипционна активност. Това са т. нар. гигантски политенни хромозоми в ларвите на плодовата мушица Drosophila и други двукрили насекоми. Образуват се, като ДНК се удвоява много пъти, без клетката да навлезе в делене. Многото еднакви нуклеопротеинови нишки се подреждат надлъжно една до друга. Хомолозите също застават плътно един до друг, така че при Drosophila виждаме само 4 гигантски хромозоми при диплоиден брой 8. Макар че клетката е в интерфаза, хромозомите са добре очертани и разграничени една от друга. Всяка от тях е нашарена с напречни тъмни дискове и светли междудискови области. Те не трябва да се бъркат с ивиците на диференционалното оцветяване: много по-фини са и се появяват "сами", без да се използват специални методи.