ГЕНИ. СИНТЕЗА И ЗРЕЕНЕ НА РНК
1. Понятие за ген и РНК
Гени наричаме единиците на наследствената програма на организма. Доколкото наследствената програма е записана в ДНК, гените са части от нейната макромолекула. ДНК съхранява информацията надеждно, но е толкова инертна, че не е годна за нищо друго. Затова ДНК-записът не може да се използва пряко. Използването на наследствената информация изисква експресия (осъществяване) на съответните гени. Генната експресия винаги започва с прехвърляне на информацията върху РНК.
Рибонуклеиновата киселина (РНК) подобно на ДНК е полимер, изграден от 4 вида нуклеотиди. Те се наричат рибонуклеотиди и се различават от дезоксирибонуклеотидите по пентозата и една от базите. Вместо дезоксирибоза в състава им участва рибоза, а вместо тимин – близката по строеж база урацил.
Свързвайки се помежду си чрез 5' – 3' фосфодиестерни връзки,
рибонуклеотидите образуват полинуклеотидна верига, подобна на тази на ДНК.
За разлика от ДНК молекулата на РНК по принцип е едноверижна. Някои участъци от нея могат да бъдат двойноспирални, но това се постига не чрез свързване на две отделни комплементарни вериги, а чрез извиване на единствената верига на 180 градуса и сдвояването й сама със себе си във вид на бримка. Разбира се, бримки могат да се образуват само ако в първичната структура са предвидени взаимно комплементарни участъци.
2. Синтеза на РНК – транскрипция (презаписване)
Синтезата на РНК се нарича транскрипция или презаписване (на ДНК), защото се извършва върху ДНК-матрица и продуктът прилича на матрицата като препис на оригинал. Доколкото са копие само на част от ДНК и са едноверижни, молекулите РНК са много по-малки, по-подвижни и могат да преминат през цялата клетка. След като си свършат работата, могат да бъдат премахнати, без да се засяга геномът. Някои РНК, по-точно рибозомната и транспортната, са крайният продукт на своите гени. На повечето гени обаче съответства матрична РНК, която не е краен продукт, а посредник между ДНК и рибозомите. мРНК е абсолютно необходима за белтъчната синтеза: при нито един организъм не са открити рибозоми, способни да работят направо с ДНК.
По механизма си транскрипцията прилича на репликацията. Субстрат отново са свободни нуклеотиди, макар и не дезоксирибо-, а рибонуклеотиди. Те се използват във вид на трифосфати. Подбират се чрез комплементарно свързване с оголен участък от ДНК-матрицата. След това ензим образува помежду им фосфодиестерни връзки, при което се отделя пирофосфат и се разгражда. Ензимът се нарича ДНК-зависима РНК-полимераза, за по-кратко РНК-полимераза. Той синтезира полинуклеотидната верига на РНК в посока от 5' към 3'.
Докато при репликацията и двете вериги на ДНК служат като матрици, при транскрипцията РНК се изгражда само върху едната ДНК-верига, наречена матрична. Друга разлика е, че двете вериги на ДНК не се разделят по цялата си дължина и завинаги, а само в неголям участък за кратко време. Затова тук не е необходима хеликаза. Самата РНК-полимераза, свързвайки се с ДНК, кара двете й вериги да се разделят.
Транскрипцията включва три етапа. През първия, наречен инициация (започване), РНК-полимеразата се ориентира в положението. Презаписването не може да започне от случайно място. Трябва да се разбере къде има ген, къде е началото му и накъде продължава, т.е. коя е матричната му верига. Ензимът получава тази информация от първичната структура (нуклеотидната последователност) на ДНК. Участъкът от ДНК, разпознаван като сигнал за транскрипция, се нарича промотор. Той обикновено се намира точно преди презаписваната част на гена. След като се свърже с промотора, ензимът предизвиква разтваряне на веригите и поставя началото на бъдещата РНК, като образува фосфодиестерна връзка между първите 2 нуклеотида.
Вторият етап се нарича елонгация (удължаване).
Състои се в монотонно присъединяване на нуклеотиди към растящата РНК-верига.
Принципът на реакцията беше вече описан. Ето как се присъединява следващият
нуклеотид:
След като свърже първите няколко нуклеотида, ензимът
се премества и заедно с него се движи отвореният участък от ДНК. Матричната
верига в този участък е свързана с изграждащата се РНК в хибридна двойна верига.
Така РНК (транскриптът, преписът) се удължава. Зад РНК-полимеразата двойноспиралната
структура на ДНК се възстановява, измествайки РНК-продукта навън. Обща схема
на елонгацията може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.979.
Доколкото е нужна определена РНК, а не огромен препис от цялата хромозома, върху
ДНК към всеки промотор е предвиден и участък за прекратяване на транскрипцията,
наречен терминатор. Когато РНК-полимеразата го достигне, тя го разпознава и
презаписването навлиза в последния си етап – терминация (завършване). Ензимът
спира да пълзи по ДНК и се отделя от нея. РНК също се освобождава и започва
самостоятелно съществуване.
Обща схема на цялата транскрипция има на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.975.
3. Регулация на транскрипцията при прокариотите
Всяка клетка е способна на твърде много дейности, за да ги поддържа постоянно. Някои от тях ще се окажат неуместни за момента, а други, осъществени едновременно, не биха довели до нищо добро. За да живее клетката, трябва всеки неин ген да се експресира тогава и само тогава, когато продуктът му е нужен. Следователно може да се очаква строг контрол на генната експресия. При прокариотите той се осъществява практически изцяло на етап инициация на транскрипцията.
Инициацията се регулира чрез специфично взаимодействие на белтъци с ДНК-последователности. Специфичността на свързването отличава регулаторните белтъци от такива като хистоните, които са способни да се закрепят където и да е по ДНК. Специфичното разпознаване поставя пред белтъка високи изисквания. Той трябва да има пространствено сродство към "своя" участък от ДНК, както ензимът е нагоден към субстрата, антитялото – към антигена или рецепторът – към хормона.
Първото взаимодействие белтък – ДНК, свързано с регулацията на транскрипцията, е разпознаването на промотора от РНК-полимеразата. Прокариотната РНК-полимераза се състои от 5 субединици. Една от тях, наречена сигма-субединица или сигма-фактор, има функцията да разпознае промотора и е нужна само за започването. Щом се образува първата фосфодиестерна връзка, сигма-субединицата се отделя от другите субединици на ензима и ги оставя сами да удължават РНК.
ДНК-последователността на промотора го "легитимира" пред сигма-субединицата, а после й посочва откъде да започне презаписването и върху коя верига. Може да се очаква последователностите, натоварени с тези функции, да бъдат еднакви или почти еднакви при всички промотори. Изследването на различни бактериални промотори е разкрило 2 консервативни участъка, разположени малко преди кодиращата част на гена. Те при инициацията едновременно реагират със сигма-субединицата. На долната схема двата важни участъка са дадени удебелени, а субединиците на РНК-полимеразата (от които само сигма е надписана) са показани в различни цветове.
Свързване на сигма-субединицата с промотора. Опростено
по Hochschild & Dove (1998).
Първичната структура на промотора влияе върху честотата
на презаписването му: някои промотори свързват РНК-полимеразата по-ефективно
от други. Освен това честотата на транскрипцията зависи от регулаторни белтъци.
Някои от тях намаляват и спират презаписването, което без тях върви добре, и
се наричат репресори. Други, наречени активатори, усилват транскрипцията или
изобщо я правят възможна.
При прокариотите гените, които кодират функционално свързани продукти (например ензими от един биохимичен път), обикновено са плътно един до друг и се презаписват заедно. Заетият от тях участък се нарича оперон. Ще разгледаме регулацията на презаписването на най-известния оперон – т. нар. лактозен оперон на E. coli. Той кодира 3 белтъка, нужни за разграждането на лактозата. Гените им са подредени в бактериалната хромозома по следния начин:
Ензимът бета-галактозидаза хидролизира лактозата
до глюкоза и галактоза. Бета-галактозидпермеазата осигурява влизането на лактозата
в клетката. Третият ензим не е толкова важен. Той служи за обезвреждане на евентуални
отровни аналози на лактозата. Терминаторът, който е зад неговия ген, не е показан.
Ако около клетката липсва лактоза, оперонът не се презаписва. Безсмислено е да се трупат ензими, ако субстрата го няма. Транскрипцията се предотвратява от репресор. Той се свързва специфично с ДНК-участък, наречен оператор. На схемата операторът е даден след промотора, а всъщност двата участъка отчасти се припокриват. Настанявайки се върху оператора, репресорът пречи на РНК-полимеразата да се добере до промотора.
Ако в следата се появи лактоза, малко от нея успява да влезе в клетката. В цитозола тя се свързва алостерично с репресора. Молекулната форма на репресора се променя, той губи сродството си към оператора и се отделя от ДНК. РНК-полимеразата безпрепятствено се свързва с промотора и транскрипцията започва. Ето схема на описаните взаимодействия:
4. Регулация на транскрипцията при еукариотите
4.1. Влияние на организацията на хроматина
За да се презаписва ДНК, първото условие е тя да бъде достъпна за молекулите-участници в процеса. Митотичните хромозоми и хетерохроматинът не са годни за транскрипция поради твърде плътната си опаковка. Това се използва за регулация: големи участъци от ДНК при нужда се изключват от презаписването, като се превръщат във факултативен хетерохроматин. Най-известният пример е половият хроматин (телцето на Бар) в женските бозайници. Тъй като нормалната женска има 2 Х-хромозоми, а нормалният мъжки – само една, ако не се вземат мерки, продуктите на всички гени от Х-хромозомата биха се получавали двойно повече в женските, отколкото в мъжките. За да не се стига дотам, едната Х-хромозома в соматичните клетки на женската се хетерохроматинизира. Това става още през зародишното развитие. Във всяка клетка хромозомата, която ще се инактивира, се избира измежду двата хомолога случайно, така че женският индивид е мозайка. Неактивната хромозома може да се види в много клетки като тъмно петънце под ядрената обвивка, наречено полов хроматин или телце на Бар.
Телце на Бар в клетки от човешка устна лигавица.
А. Клетка от жена – половият хроматин е горе в периферията на ядрото. Б. Клетка
от мъж – телце на Бар липсва. Около ядрата се виждат бактерии от устната микрофлора.
Хетерохроматинизацията обаче не е широко използван
контролен механизъм, защото работи само за големи части от генома. Регулацията
чрез опаковане (и разопаковане) обаче действа и в еухроматина. Основа на неговата
структура е 30 nm-нишка. Транскрибираните участъци обаче са разхлабени до "наниз
от мъниста" чрез отделяне на хистона Н1. В областта на промотора от ДНК
се откъсват и останалите хистони, за да бъде двойната спирала достъпна за нехистоновите
белтъци, участващи в транскрипцията. Следователно хистоните могат да се смятат
не само за структурни белтъци, а и за неспецифични репресори на генната активност.
По-долу регулацията на транскрипцията ще се разглежда с допускането, че хроматинът вече е структурно подготвен.
4.2. Особености на еукариотната генна експресия
Еукариотните промотори имат далечна прилика с прокариотните. В еукариотните хромозоми няма оперони. Гените са разпръснати и всеки има собствен промотор и терминатор.
Като цяло еукариотният геном, сравнен с прокариотния, е много по-инертен. В бактериалната клетка основна роля играят репресорите, а без тях повечето оперони са готови за употреба. При еукариотите е обратното: гените поначало са в неактивно състояние, а за да се включи някой от тях, трябват специални усилия. Съответно еукариотните белтъци, регулиращи генната експресия, са изключително от тип активатори.
Свързването на РНК-полимеразите с промоторите им става по механизъм, различен от този при бактериите. Ензимите не разпознават самите промотори. Първо с промотора се свързва белтък, наречен общ транскрипционен фактор. След това РНК-полимеразата се присъединява към комплекса общ транскрипционен фактор – промотор. По функция еукариотните общи транскрипционни фактори напомнят прокариотните сигма-фактори. Има обаче съществена разлика: докато сигма-факторите разпознават промотора само ако са свързани с останалите субединици на РНК-полимеразата, еукариотните транскрипционни фактори разпознават промотора сами и едва тогава се свързват с РНК-полимеразата. Затова сигма-факторът се смята за субединица на РНК-полимеразата, а транскрипционните фактори по-скоро приличат на "обикновените" транскрипционни активатори.
При еукариотите освен промоторите има и други ДНК-участъци, важни за презаписването на гените. Те се наричат енхансери (enhance, англ. – усилвам). Упражняват активиращото си действие от голямо разстояние (над 100 нуклеотидни двойки в коя да е посока) и запазват активността си, ако се обърнат на 180 градуса. Повечето енхансери са на няколко хиляди нд от промотора си. Те обаче се оказват точно до него, когато ДНК се огъне подходящо. Бактериите също имат такава регулация, но за малък брой гени и тези прокариотни последователности се описват, без да се наричат енхансери. При еукариотите, обратно, почти всички изучени гени имат по 1 – 2 енхансера. Действието на енхансерите се опосредства от белтъци-регулатори. Те се свързват с ДНК-последователността на енхансера и подпомагат транскрипционните фактори или самата РНК-полимераза.
Има много ДНК-разпознаващи белтъци, които регулират презаписването на различни гени, като се свързват било с промоторите, било с енхансерите им. Пример са рецепторите за половите хормони и хормоните на щитовидната жлеза.
Един регулаторен белтък влияе върху експресията на редица гени и те могат да се презаписват толкова съгласувано, колкото и в бактериалния оперон. И обратно, един ген се регулира от няколко белтъка. Не за всички има отделни прицелни участъци – някои разпознават една и съща ДНК-последователност и се конкурират за нея. Освен това отделните регулаторни белтъци донякъде се повтарят при различните гени, така че регулацията на целия геном не изисква безкраен техен набор.
4.3. Регулаторни каскади в индивидуалното развитие
Регулаторните белтъци не са равностойни. Има йерархия, при която продуктът на даден регулаторен ген активира други "по-нискостоящи" регулаторни гени. Такива каскади се проявяват най-ярко в индивидуалното развитие на многоклетъчните животни. На върха на йерархията стоят малък брой гени, отговорни за определянето на полярността на тялото, а по-късно за оформянето на цял телесен сегмент или орган.
При дрозофилата отдавна е описан ген, чиито мутации водят до недоразвити очи или пълна липса на очи. Затова той е наречен eyeless (англ. който няма очи). Много по-късно се установява, че продуктът на eyeless носи белезите на транскрипционен активатор. Самият ген показва над 90% прилика с човешкия ген Aniridia и мишия Small eye, чиито мутации причиняват дефекти във всички части на окото – ирис, леща, роговица и ретина. Поначало гените от върха на каскадата са еволюционно консервативни, защото промяна в някой от тях би засегнала всички по-долни стъпала. Странното е, че приликата в гена се съчетава с големи разлики в самия орган. Очите на насекомите са устроени и функционират съвсем различно от очите на бозайниците.
Изказва се хипотезата, че eyeless отговаря за "поява на око тук и сега", а самото око всяко животно образува както може. Хипотезата е проверена, като в Drosophila е предизвикана експресия на eyeless в части на зародиши, където нормално тя липсва. Резултатът са мушици с допълнителни очи на необичайни места – вместо или върху антените, по или под крилата, по краката – до 14 очи върху една мушица. Допълнителните очи, макар и по-малки, са нормално устроени. Освен това фоторецепторните им клетки реагират на светлина, т.е. очите виждат нещо. Снимки на индуцирани по този начин очи могат да се видят на http://homepage3.nifty.com/yd/creatures/gallery/eyeless.htm.
В някои мушици вместо eyeless е въведен и експресиран мишият ген Small eye. Той предизвиква развитие на допълнителни очи точно като собствения ген на плодовата мушица eyeless. Забележително е, че експресията на един-единствен ген води до образуване на сложно око, като при това побеждава нормалните програми за диференциране.
5. Зреене на РНК (процесинг)
РНК, която слиза от ДНК-матрицата, се нарича първичен транскрипт или пре-РНК. Някои РНК не могат да работят в този си вид. Превръщането на първичния транскрипт във функционално годна РНК се нарича зреене или процесинг (processing, англ. – преработване).
Както при прокариотите, така и при еукариотите рРНК и тРНК се синтезират включени в твърде дълги РНК-вериги. Зреенето им се състои в изрязване на излишните части. Няма да разглеждаме този процес.
Прокариотните мРНК не зреят – синтезират се във вид, годен за незабавна употреба. Еукариотните мРНК, обратно, винаги зреят и процесингът им е по-сложен от този на рРНК и тРНК. Ще се спрем на него по-подробно.
Зреенето на еукариотните РНК протича на мястото на синтезата, т.е. в ядрото. Едва след като зреенето им завърши, те се допускат да излязат в цитозола, за да изпълняват функцията си.
Почти веднага след като РНК-полимеразата започне да синтезира пре-мРНК, към подалия се 5'-край на РНК друг ензим присъединява ГТФ чрез особена връзка – 5'-5' трифосфатна (ГТФ и РНК се свързват "глава с глава"). Тази модифицирана структура в предния край на мРНК се нарича шапка. Нейна схема е дадена на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=cap&rid=cell.figgrp.1010.
3'-краят на пре-мРНК се модифицира по друг начин. При гените за мРНК последователността ААТААА служи като сигнал за край на транскрипта. (Но не и за край на транскрипцията – терминаторът е доста по-нататък.) Ензим разпознава сигнала ААУААА в РНК и срязва веригата малко след него. После добавя към новообразувания 3'-край 100-200 аденинови нуклеотида – процес, наречен полиаденилиране. Получава се т. нар. полиА-опашка. Докато шапката е задължителна, има няколко мРНК, при които опашката нормално липсва.
Освен в края си повечето еукариотни гени имат "излишни" последователности и в средата си. Те са накъсани: кодиращи ДНК-участъци, наречени екзони, се редуват с некодиращи, наречени интрони. Всеки интрон трябва да се изреже от пре-мРНК и екзоните от двете му страни да се съединят – процес, наречен снаждане или сплайсинг.
За снаждането отговаря сложен многоензимен комплекс, наречен сплайсозома. Тя разпознава интроните по нуклеотидната последователност на краищата им. Схема на сплайсозомата и нейната работа може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1709.
Пътят от ДНК до зряла мРНК е даден на долната схема. Нарисуваната цялостна необработена пре-мРНК е абстракция – в действителност процесингът на 5’-края започва още преди 3’-краят да е синтезиран.
6. Регулация на зреенето на еукариотната
мРНК
При еукариотите генната експресия се регулира и на етап зреене. Докато контролът на транскрипцията е на принципа "всичко или нищо", при зреенето въпросът е не само дали ще протече или не, а и по какъв начин ще протече. Понякога зреенето е алтернативно – има различни възможности за сплайсинг или/и полиаденилиране. мРНК може да бъде различно дълга и да включва различен набор от екзони. Обикновено след транслацията й се получават родствени белтъци (изоформи), които обаче се различават по някое важно свойство.
Антителата се образуват от бели кръвни клетки, наречени В-лимфоцити. Отначало антитялото е върху повърхността на В-клетката като мембранен рецептор. Ако проникне антиген, който това антитяло-рецептор разпознава, двете молекули се свързват със слаби връзки. В-лимфоцитът, на чиято повърхност става това, се активира. След делене и диференциране той дава многобройни крайно диференцирани В-лимфоцити, наречени плазмоцити. Те нямат рецептори, но пък секретират разтворими антитела. Рецепторът и разтворимото антитяло се различават само по края на молекулата си. Мембранно-свързаното антитяло-рецептор съдържа там допълнителен хидрофобен пептид за закотвяне в мембраната. Този пептид се кодира от последния екзон на гена, който в нестимулирания В-лимфоцит присъства в зрялата мРНК, а в плазмоцита се изрязва от нея.
Сравнение между В-лимфоцит, все още нестимулиран
от подходящ антиген, и плазмоцит. Хидрофобният мембранен участък на антитялото-рецептор
е даден в оранжево.
Възможността от един ген да се получават донякъде
различни белтъци чрез алтернативно зреене е може би основната изгода, която
интроните носят на еукариотната клетка. Освен това накъсаните гени по-лесно
еволюират, защото екзоните им могат да се удвояват, изрязват и съчетават по
нови начини.
Основни източници
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London, 1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
За бактериалната РНК-полимераза:
Hochschild A., S.L. Dove (1998). Protein-protein contacts that activate and repress prokaryotic transcription. Cell 92: 597-600.
За eyeless:
Barinaga М. (1995). Focucing on the eyeless
gene. Science 267: 1766-1767.
Halder G., P. Callaerts, W. Gehring (1995). Induction
of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila.
Sciеnce 267: 1788-1792.
Copyright © Майя Маркова
| Предишен раздел | Начало | Следващ раздел |