ГЕННО ИНЖЕНЕРСТВО (РЕКОМБИНАНТНИ ДНК-МЕТОДИ). ИЗСЛЕДВАНЕ НА СТРУКТУРАТА НА ДНК
Рекомбинантната ДНК не е – както би могло да се помисли, – ДНК, претърпяла рекомбинация. Рекомбинантни ДНК-молекули наричаме тези, които са създадени от човека чрез съединяване на фрагменти ДНК от различни източници. Методите, свързани с тези молекули, общо се наричат рекомбинантни ДНК-технологии или генно инженерство. Всъщност много от методите, споменати по-долу, се използват и извън генното инженерство. В кратките курсове има склонност теориите да се дават наготово като догми, без подкрепящите ги опитни данни. Затова е добре поне да прегледаме набързо някои от методите, с които са били събрани въпросните данни. (Дотук единственият такъв преглед беше раздел Белтъци – методи за изследване.)
Генното инженерство става необходимо, когато изследването на генома в естествения му вид започва да дава все по-малко информация срещу все повече време и труд. Хромозомите, каквито и да са другите им качества, се изучават трудно. (Известно е, че природата не е устроена по принципа на най-голямото удобство за изследователя.) Генното инженерство привежда природната ДНК в удобен за изследване вид. Рекомбинантните ДНК-молекули са два типа: такива, в които съхраняваме някаква изследвана ДНК с непроменена последователност, и такива, в които интересуващата ни ДНК е със силно модифицирана последователност, но в замяна на това работи. Съответно имаме две групи рекомбинантни ДНК-методи, свързани съответно със структурата и с функцията на ДНК. Настоящият раздел е посветен на първата група методи, т.е. на изучаването на ДНК-последователностите сами по себе си.
Много последователности ДНК се оценяват като интересни и достойни за подробно изследване. Произволни примери са дрождените центромери и човешките глобинови гени. В родния си геном обаче всяка последователност се губи сред другите като игла в копа сено. За да може да се изследва, тя трябва да се извади и да се сложи на друго място така, че да може после лесно да се извлече в чист вид. "Другото място" е прието да бъде малка извънхромозомна молекула ДНК на чревната бактерия Escherichia coli. Това означава или плазмид, или геном на ДНК-фаг. Включването на даден ДНК-фрагмент в молекула ДНК, която трайно се възпроизвежда в определени клетки и лесно може да се извади оттам, се нарича клониране.
1. Рестриктази
Като начало ДНК, в която ще се търси "нашата" последователност, трябва да се пречисти от останалите съставки на клетката. Започва се с проправяне на път към ДНК. Ако тъканта е плътна, тя първо се разрушава механично (хомогенизира се). Мембраните се разтварят с детергент. Белтъците или се смилат с протеази, или се екстрахират (извличат) с фенол. РНК може да се разгради с РНази. Накрая ДНК се пречиства по класическия химически начин чрез неколкократно преутаяване.
В хода на тази процедура, колкото и да внимаваме, ДНК търпи известно механично увреждане: двойната спирала се къса на случайни места. Получените фрагменти не са удобни за по-нататъшната работа. Трябва парчетата ДНК да започват и завършват на определени места, иначе изобщо няма да знаем с какво работим. Затова с цената на допълнително накъсване се получават нови краища, които отговарят на известен на нас олигонуклеотид. За целта се използват рестрикционни ендонуклеази (рестриктази) – бактериалните ензими, които защитават клетката от фаги, като хидролизират проникналата чужда ДНК (вж. раздел Репарация). Те разпознават определен палиндром (къса симетрична последователност) и срязват ДНК точно в палиндрома.
Днес са търговски достъпни стотици рестриктази. Няколко от тях са дадени в таблицата. Означенията на рестриктазите се образуват по следния начин: една буква за родовото име на бактерията, две букви за видовото й име, евентуално буква или число за конкретния щам и римско число, показващо кой поред е бил изолиран този ензим от въпросната бактерия. Например първата рестриктаза, получена от щам RY13 на Escherichia coli, се означава като EcoRI.
От таблицата се вижда, че някои ензими като BamHI срязват двете вериги със забележимо отместване. Получените краища се наричат лепливи, защото имат едноверижни "висулки", склонни към комплементарно свързване. Други рестриктази като HpaI правят равно двуверижно срязване и дават т. нар. тъпи краища.
2. Вектори
След рестриктазната обработка ДНК-фрагментите са готови да се настанят на новото си място, а именно в малка молекула ДНК, способна да ги вкара в клетката и да им осигури трайно съществуване и възпроизвеждане. Тази малка молекула се нарича вектор (от лат. vector – водещ).
По-горе се спомена, че като вектори служат плазмиди и фагови геноми. За изучаване на структурата на ДНК по-удобни са фагите. Техният геном побира по-големи парчета чужда ДНК. Освен това фагите осигуряват по-ефективно клониране, защото по-добре се справят със задачата да проникнат в бактериалната клетка отвън.
Като фагови вектори отдавна не се използват природни фаги. За да бъдат по-удобни за генното инженерство, самите вектори са предварително модифицирани чрез методите на генното инженерство. Конкретен вектор, наречен Lambda DASH II, е показан на адрес http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=272 (тази страница спада към каталога на фирмата-производител). Векторът се основава на природния ДНК-фаг ламбда. Понеже генетичната му карта е предназначена за подготвени потребители, уместно е да я поясним. Геномът на природния ламбда-фаг има следния вид:
В генома на вектора на две места в средата е вмъкнат малък олигонуклеотид с нагъсто събрани места за редица рестриктази. Такива последователности, наречени полилинкери (англ. – прибл. значение "за много връзки"), липсват в природната ДНК. Синтезират се химично и се въвеждат във вектора, за да може експериментаторът да избира между няколко рестрикционни ензима. Схемата добива следния вид:
3. Получаване на геномна библиотека
На подробната карта на вектора (вж. горепосочения адрес) с триъгълни стрелки са дадени рестриктазите, чиито места се съдържат в полилинкерите. Ензимът, с който сме нарязали предназначената за клониране ДНК, трябва да е между тях.
Векторът се обработва със същия рестрикционен ензим. Пълнежът се изрязва и остава "извън уравнението". И без това при клонирането не е нужна лизогения.
Към вектора се добавя пречистената от нас ДНК. Тя се вмъква на мястото на пълнежа. Добавя се ензимът ДНК-лигаза, за да се образуват ковалентни връзки и да се получи цялостна рекомбинантна молекула. Процесът протича най-гладко при лепливи краища, както е дадено на долната схема, но върви и с тъпи краища. Включената ДНК за по-кратко се нарича инсерт (от лат. inserto – вмъквам).
След лигазната реакция ДНК се смесва с ламбда-фагови белтъци. Получават се вириони, както би станало в заразена с ламбда-фаг бактерия. Ето схема на действията дотук:
Фагите се оставят да се развиват в клетки на E. coli– но не обикновена E. coli. Бактериите, принудени да се жертват за поддържането на вектора, са от щамове, специално приспособени за генното инженерство. Първо, те са лишени от системи за рестрикция и модификация. Никой не би се зарадвал, ако получената с толкова труд рекомбинантна ДНК се унищожи от рестриктаза на клетката-гостоприемник. Второ, тези бактерии са мутанти, неспособни на рекомбинация (като се почне с конюгацията и се свърши с рекомбинативната репарация). Така се избягва опасността инсертът да се изгуби или промени при рекомбинация. Изобщо в рекомбинантните ДНК-методи всяко преустройство на ДНК, ако не е планирано, трябва да се предотврати. Трето, за да бъдат точковите мутации възможно най-редки, някои гени на SOS-отговора са инактивирани. Така се изключват неточните, но бързи механизми, с които нормалните бактерии спасяват силно увредена от мутагени ДНК. "Генноинженерните" щамове при същата доза мутагени няма да получат допълнителни мутации, а просто ще умрат.
Бактерия, загубила толкова важни гени, трудно би преживяла, ако се окаже на свобода. Освен това въпросните щамове E. coli имат и метаболитни дефекти, поради които са взискателни към хранителната среда. В зората на генното инженерство широко се е обсъждала възможността опасни рекомбинантни ДНК-молекули да се разпространят безконтролно. Днес тези страхове изглеждат донякъде преувеличени, но все пак строго се спазва правилото да се използват само бактерии, неспособни да се развиват нито в организма, нито във външната среда.
Да се върнем на клонирането. В Петриева паничка (петри) се налива среда за култивиране на чревни бактерии. Средата е разтвор от хранителни вещества, желиран с т. нар. агар – извлек от определени водорасли от Индийския океан. Важната съставка в агара е полизахаридът агароза, който образува гел и така желира разтвора. Използването на гел е наложително, за да не могат клетките и фагите да се движат свободно и да се разбъркват.
Върху желираната среда се добавя суспензия E. coli и се разстила по цялото петри. Изчаква се бактериите да се размножат и да покрият средата с белезникав слой. Добавя се фагова суспензия, разредена така, че вирионите да се окажат на разстояние един от друг. След известно време на белезникавата повърхност се появяват прозрачни кръгчета – фагови колонии. Колония в случая означава група вируси или клетки с общ произход, които живеят заедно. Фаговите колонии се наричат още стерилни петна, защото във вътрешността им бактериите са лизирани. По ръба на петното фагите атакуват нови бактерии и така се разпространяват навън. Всички те са потомци на един фаг, попаднал там, където сега е центърът на прозрачния кръг.
Такава група организми, клетки или вируси, получени от един предшественик чрез безполово размножаване, се нарича клон. Макар че не трябва да се забравя за мутациите, генотиповете в рамките на клона могат за практически цели да се приемат за еднакви. Оттук идва и терминът клониране: да клонираме дадена последователност значи да получим клон, който да я съдържа в удобен за работа вид.
Нарисуваното по-горе петри съдържа десетина колонии. В действителност едно петри може да побере десетки, дори стотици дребни колонии. Следователно, ако за опита сме използвали десетина петрита, може да имаме хиляди клонове. В генното инженерство съвкупност от клонове, съдържащи различни фрагменти ДНК от един източник, се нарича библиотека. В нашата библиотека включената ДНК е във вида, в който е била в изходния геном, само е понарязана. Такива библиотеки, предназначени за изучаване на структурата на ДНК, се наричат геномни.
4. Първично скриниране на библиотеката със сонда
Никога няма пълна гаранция, че произволна последователност от изходния геном се съдържа и в библиотеката. Все пак, ако клоновете са многобройни и носят дълги инсерти, най-вероятно търсената от нас последователност наистина е между тях. Тя обаче все още е скрита като игла в копа сено. Имаме хиляди клонове, от които няколко най-вероятно отговарят на нашата цел, но не се обаждат.
Трябва нужните клонове да се изкарат наяве. Изследване, при което се проверяват голям брой обекти, за да се намерят между тях няколко с определени свойства, се нарича скриниране (от англ. screen – пресявам). Библиотеките се скринират чрез сонди, които се свързват специфично с търсените от нас молекули и така разкриват присъствието им.
При скриниране на геномна библиотека се използва комплементарно взаимодействие на нуклеинови киселини. Сондата съответно ще бъде пречистен фрагмент ДНК или (по-рядко) РНК. Тя или също е рекомбинантен продукт, или се синтезира химично. Сондата може да бъде точно тази последователност, която търсим, или (по-често) част от нея. Може да бъде не същата, но подобна последователност, например със сонда миши албуминов ген да претърсваме човешка геномна библиотека за човешкия албуминов ген. Най-накрая, ако за търсената последователност се знае само локусът, може като сонда да се използва последователност, тясно скачена с нея.
За да може сондата да открие комплементарната клонирана ДНК, трябва първо и двете да се денатурират, т.е. двойната спирала да се раздели на две единични вериги. Обикновено това се постига чрез нагряване. После сондата се добавя към другата ДНК и се създават условия за комплементарно свързване (хибридизация).
Преди употреба сондата трябва да се бележи. Радиоактивно белязване се извършва с нуклеотиди, съдържащи радиактивен изотоп на фосфора (32Р). После белегът се проявява или визуализира (т.е. прави видим) чрез авторадиография. Използва се и нерадиоактивно белязване. Например с част от нуклеотидите може ковалентно да се свърже витаминът биотин. Нерадиоактивният белег се визуализира по-трудно, но е разбираемо защо мнозина го предпочитат при работата си.
Един начин да се бележи сондата е да се закачи белег в единия й край – крайно белязване. За целта към сондата се добавя белязан АТФ и ензим, наречен полинуклеотидкиназа. Ензимът прехвърля белязани фосфатни групи от АТФ към 5’-края на сондата. На схемата белегът е означен с червено.
Също така може сондата да се бележи по-интензивно, като се използва цялата й дължина. За целта върху сондата се урежда матрична синтеза на комплементарна верига с белязани нуклеотиди. Ето два начина за това:
И при двата начина се използва склонността на ДНК-полимеразата да удължава свободен 3'-ОН край на полинуклеотидна верига. При белязването чрез ник-транслация такива краища се създават от ендонуклеаза, която прави никове. После се добавя ДНК-полимераза с 5'-3' екзонуклеазна активност. Тя измества никовете, заменяйки небелязаните нуклеотиди с белязани.
При белязването със случайни праймери небелязаната сонда се денатурира и се оставя да хибридизира с къси праймери със случайна последователност. Те намират някъде комплементарна последователност и се настаняват срещу нея. После ДНК-полимераза ги удължава с белязани нуклеотиди.
Получената белязана сонда не се изсипва направо в петрито, където се развиват фагите. Вместо това към повърхността на петрито се притиска лист нитроцелулозна хартия, така че някои клетки и фаги да останат върху листа. Нитроцелулозната хартия има свойството да свързва и задържа ДНК (а също така и белтъци). По-нататък се работи с хартията – вж. схемата, която се отнася за радиоактивно белязана сонда.
На схемата две колонии от петрито са интересни – съдържат ДНК, която хибридизира със сондата.
Ако белегът не е радиоактивен, визуализирането включва повече етапи. Да вземем за пример гореспоменатия биотин. С него специфично се свързва белтъкът авидин, съдържащ се в яйчения белтък. Може да се закупи пречистен авидин, конюгиран (т.е. здраво свързан) с ензим, катализиращ цветна реакция. Ходът на реакцията е даден на следващата схема. Промиванията не са означени.
5. Вторично скриниране. Садърн-блот
Радиоактивно или не, първото скриниране е с предварителен характер. То е твърде грубо, за да бъде окончателно. Отбраните чрез него няколко десетки клона се подлагат на второ, по-старателно скриниране, при което се проверява дължината (молекулната маса) на включените фрагменти. Постъпва се по следния начин: Взема се по малко материал от колониите, дали положителна реакция. ДНК се извлича (в отделни епруветки!). Редно е да се вземе и ДНК от източника, от който е започнало всичко. Добавя се старата рестриктаза, за да се получат фрагменти със стандартни краища.
Следва електрофореза в агарозен гел. Това е най-обичайният гел за електрофореза на нуклеинови киселини. Подобен е на агаровия, но се получава от пречистена агароза и се използва за по-фина работа. Всяка проба се поставя в отделна ямка (старт) в началото на гела. Обикновено на един старт се нанасят и маркери за молекулна маса, т.е. смес от парчета ДНК с известна дължина.
След електрофорезата гелът се долепя плътно до парче нитроцелулозна хартия. ДНК се оставя да премине върху хартията по капилярен път. Хартията се отделя от гела и се обработва по същия начин като кръглите отпечатъци от петритата по-рано. Разликата е, че вместо кръг с точки ще се получи правоъгълник с чертички. Ивиците са толкова по-отдалечени от старта, колкото по-нискомолекулни са съответните фрагменти ДНК. Точната им маса може да се определи чрез сравнение с маркерите.
Описаният метод, включващ рязане на ДНК с рестриктази, електрофореза, пренос върху хартия, хибридизация и проявяване, се нарича Садърн-блот. Садърн (Southern) е името на откривателя, а блот (англ. blot – правя петно) произлиза от появата на тъмни ивици върху нитроцелулозната хартия.
По-красиво нарисувана схема на Садърн-блот може да се види например на адрес http://cgil.uoguelph.ca/QTL/SouthernBlotting.htm.
Методът на първото скриниране (с отпечатъците от петритата) се основава на същия принцип и понякога се нарича точков Садърн-блот. Електрофорезата при истинския Садърн-блот обаче дава много важни сведения за дължината на фрагментите. Изискванията тук се повишават и затова малко клонове, дали добри точки, после дават също толкова добри ивици. За добри се смятат ивиците, които са ярки (силна реакция със сондата) и разположени близо до стартовете (т.е. парчето е дълго). На схемата са дадени две проби (да кажем, отговарящи на двете реагиращи колонии от първото скриниране) и от тях проба 1, нанесена на средния старт, дава добра ивица.
Скринирането чрез Садърн-блот е само едно от приложенията му. Поначало Садърн-блотът е метод да се установи дали в даден геном присъства определена ДНК-последователност или поне много подобна на нея. По-горе споменахме, че можем да клонираме например човешки албуминов ген, използвайки като сонда миши албуминов ген. Преди такова клониране обаче задължително трябва да се проведе Садърн-блот, за да се види дали сондата върши работа за човешка ДНК.
Аналогично някоя последователност може да се търси с миша сонда в геном на жаба или дъждовен червей, но шансовете за успех намаляват.
В раздела за организацията на наследствения материал беше споменат метод, чрез който дадена последователност може да се локализира в ядрото или в метафазните хромозоми. Това е хибридизацията in situ (някой спомня ли си за FISH?). По принципа си тя напомня Садърн-блота и най-вече точковия му вариант. Разликата е, че ДНК не се разпъва върху хартия, а се оставя в естествената си опаковка – хроматин или метафазни хромозоми.
6. Полимеразна верижна реакция (PCR)
За второто скриниране освен чрез Садърн-блот може да се подходи и по друг начин. За целта трябва да разполагаме с две химично синтезирани олигонуклеотидни вериги, дълги 10-20 нуклеотида и комплементарни на участъци от търсената последователност. При това тези участъци трябва да се намират на двете срещуположни вериги на разстояние няколкостотин нуклеотидни двойки един от друг.
Ако всичко това е спазено, постъпва се по следния начин: Малко количество ДНК от фаговата колония се смесва с голямо количество олигонуклеотиди. Добавят се свободни нуклеотиди и ДНК-полимераза. Епруветката се нагрява и ДНК се денатурира.
Следва охлаждане. ДНК-веригите стават склонни да образуват двойни спирали, но повечето дълги вериги вместо една с друга, както са били, се сдвояват с олигонуклеотидите. Тогава ДНК-полимеразата започва да синтезира ДНК, използвайки олигонуклеотидите като праймери.
Дава се време на синтезата да напредне. След това епруветката отново се нагрява. ДНК се денатурира... Цикълът нагряване – сдвояване – удължаване се повтаря многократно, например 10 пъти. Така ДНК-последователността между двата праймера се намножава (амплифицира).
Една по-проста схема на PCR може да се види на адрес http://advan.physiology.org/cgi/content/full/28/2/44.
Синтезата на ДНК се усилва в геометрична прогресия, защото матрицата става все повече и повече. Като при обикновените верижни реакции продуктът отново встъпва в процеса. Затова методът се нарича полимеразна верижна реакция. Означава се с PCR (съкр. от англ. polymerase chain reaction).
Когато методът PCR се е резработвал, трябвало е след всяко нагряване да се добавя нова ДНК-полимераза, защото старата се е денатурирала. По-късно е започнала да се използва ДНК-полимераза от термофилната бактерия Thermus aquaticus, обитател на горещи извори. Този ензим, означаван като Taq-полимераза, работи най-добре при 80оС и издържа нагряване до 95оС.
След като се изпълни планираният брой цикли, съдържимото на епруветката се нанася на гел и се подлага на електрофореза. След това не е нужно белязване и проявяване, достатъчно е да се оцвети с етидиев бромид. Амплифицираният фрагмент ДНК има вид на ярка ивица върху гела. Останалата ДНК е в толкова малко количество, че не се вижда. Долната снимка, взета от Delimitreva et al. (1999), показва резултат от PCR. Най-лявата пътека е с маркери за молекулна маса. Всяка от другите три пътеки съдържа намножена ДНК-последователност от единична човешка яйцеклетка след 35 цикъла на PCR. Доколкото яйцеклетката е хаплоидна клетка, в случая верижната реакция е започнала само от 2 молекули матрица – двете хроматиди на хромозомата, съдържаща съответната последователност.
В сравнение със Садърн-блота PCR е по-чувствителна, по-специфична, по-бърза и по-евтина. Може да се запита защо тя не се налага като единствен метод. Нещо повече, защо фрагментите се клонират, вместо да се амплифицират чрез PCR и така да се получат в почти чист вид? Отговорът е, че като всеки метод PCR има ограничения. Могат да се амплифицират само къси последователности – до около 5000 нд, най-добре до 2000 нд, а това не винаги е достатъчно. Още по-важно е, че специфични праймери обикновено са достъпни само за последователности, които вече са добре изучени. Затова PCR рядко се използва за разучаване на непознати територии, макар че напоследък са разработени нейни варианти и за такива цели. Тя обаче е много подходяща за стандартизирани изследвания, например диагностика на наследствени болести или откриване на патогени в тъканни проби.
Можем да си представим наследствена болест, при която важен ген е инактивиран поради голяма делеция. Ако знаем последователностите от двете страни на делецията, можем да синтезираме комплементарни на тях праймери и с тях да разработим тест за диагностика. Както знаем, такива мутации ("загуба на функция") почти винаги са рецесивни. Да предположим, че петима роднини на засегнат от болестта искат да проверят дали не са носители. Изследването им дава следния резултат:
Как следва да се тълкува получената картина? Как би изглеждала на същия гел проба от болния роднина? Може ли подобен тест да се разработи на основата на Садърн-блот?
Макар и измислен, примерът е съвсем правдоподобен. Таласемиите и редица други наследствени болести се дължат на мутация от този тип и тестовете за диагностика се основават на описания принцип.
Важно е, че изследването на ДНК може да разкрие мутацията още преди тя да се прояви фенотипно. Чрез тези тестове може да се установи генотипът на плод, като се вземе проба от зародишните обвивки – пренатална диагностика. Такова изследване е уместно, когато родителите са наследствено обременени. Ако плодът се окаже обречен да развие наследствена болест, повечето семейства приемат препоръката за аборт.
Освен в епруветка PCR може да се прави и върху препарат в тънък слой течност (PCR in situ). В този случай обаче или праймерите, или нуклеотидите трябва да бъдат белязани. Методът се препоръчва за локализиране на уникални последователности, твърде къси, за да могат да се засекат чрез обикновена хибридизация in situ.
7. Секвениране
Да се върнем на колониите в петритата. Ако поне една от тях даде прилична картина при блот или PCR, експериментаторът може да си отдъхне. Търсеният ДНК-участък е клониран, или може би част от него, или поне нещо, което много прилича на него. И все пак още е рано успехът да се обявява публично. Първо трябва да се узнае нуклеотидната последователност на инсерта. Определянето на първичната структура, наречено още секвениране (от лат. sequentia – последователност), е "връхна точка" на рекомбинантните ДНК-методи, свързани със структурата на ДНК.
Определянето на първичната структура (секвениране) може да се извърши по няколко начина. Тук ще опишем един от тях, който е открит пръв и досега остава най-широко разпространен, а също така е най-лесен за разбиране. Нарича се дидезоксинуклеотиден метод или метод на Сейнджър. Откривателят му получава за него Нобелова награда по химия през 1980 – втора след тази за секвенирането на инсулина.
За да се секвенира клонирана ДНК по метода на Сейнджър, тя първо се получава в чист вид, разпределя се в 4 епруветки и се денатурира. Прибавя се праймер, който да се свърже с едната рекомбинантна ДНК-верига точно преди началото на инсерта. Праймерът се набавя лесно, защото първичната структура на вектора е известна. Добавят се ДНК-полимераза и нуклеотиди. Но наред с обичайните нуклеотиди, които са 2’-дезоксирибонуклеозидтрифосфати, се слагат и дидезоксинуклеотиди – 2’,3’-дидезоксирибонуклеозидтрифосфати. По-точно в първата епруветка част от цитидиновия нуклеотид е дидезокси (ддЦТФ), другата част е нормален дЦТФ, а дТТФ, дАТФ и дГТФ са изцяло нормални. Във втората епруветка пък има известно количество ддТТФ, в третата – ддАТФ, в четвъртата – ддГТФ.
Понеже 3’-хидроксилната група на нуклеотида участва в образуването на следващата фосфодиестерна връзка, нуклеотид без 3’-ОН група може да се включи в ДНК-веригата, но ще бъде последният. Синтезата след него не може да продължи. Затова ще се синтезират сравнително къси вериги. Дължината им обаче силно ще варира, защото във всяка епруветка само част от съответния вид нуклеотиди са дидезокси. В някои вериги дидезоксинуклеотид ще се вмъкне още при първата възможност, а в други случаи ДНК-полимеразата 7 или 15 пъти ще включва нормалния нуклеотид, преди да попадне на дидезокси. Ето схема на събитията в епруветка Nо 1:
След това проби от четирите разтвора се нанасят на съседни стартове в гел за електрофореза. Агарозата е твърде рехава за толкова къси фрагменти – образува прекалено широки пори, затова затова се използва полиакриламиден гел както при електрофореза на белтъци. Геловете за секвениране са много дълги и към края им фрагментите са така добре разделени, че дори и един нуклеотид разлика в дължината им проличава ясно – вж. резултат от такава електрофореза.
Долен край на секвениращ гел, в който фрагментите са визуализирани чрез авторадиография. Плаката е любезно предоставена от Алексей Савов от Лабораторията по молекулярна патология към Медицинския университет – София.
Най-долната ивица отговаря на най-късия олигонуклеотид – този, при който още първият нуклеотид след праймера се е случил дидезокси. В случая пробите са нанесени на четирите старта в последователност Ц – Т – А – Г и най-долната ивица е в първата пътека, следователно първият нуклеотид от инсерта е Ц. Следващият е А, третият – Г и т. н. Можем да отгатнем следната последователност:
5' – Ц А Г Т А А Ц Т Г Г Г Г Т А Г Г Г Г Г Т…
Когато целият инсерт се секвенира, получената информация се обработва. Първичната структура разкрива смисъла си – в нея се очертават отворени рамки на четене, граници на интрони, промотори, енхансери и други регулаторни последователности. Като се знае генетичният код, от нуклеотидната последователност се прави извод за първичната структура на кодирания белтък. Ако при това се получат например двайсетина хидрофобни аминокиселини една до друга в началото на веригата, може да се предположи, че това е сигнална последователност на мембранен или секреторен белтък. Правят се цели структурни модели на белтъци, за които някой "е чел" в ДНК, но още никой не е виждал получени в чист вид. Описаната информационна обработка се извършва с помощта на компютър, макар че няма принципна пречка да напишем последователността на лист и да я огледаме лично, отброявайки нуклеотидите с паче перо. Трябва също да се провери дали секвенираната последователност е вече известна или поне прилича на някоя известна. Това става чрез справка в бази данни, където са включени всички установени досега последователности.
Описаният оригинален вариант на метода на Сейнджър впоследствие е опростен по следния начин. Четирите дидезоксинуклеотида се бележат с четири различни флуорохрома и се забъркват в една реакционна смес, която после се нанася на един старт. Цветните ивици могат да се регистрират от апарат – секвенатор. Всяка от тях, достигайки края на гела, се отчита като пик със съответния цвят (вж. следващите две фигури).
Автоматизацията на секвенирането днес позволява да се разчитат цели геноми. Първите секвенирани цели молекули ДНК са малки – плазмиди, митохондриални и хлоропластни геноми, геноми на вируси. След това са разчетени геномите на няколко бактерии, на дрождите Saccharomyces cerevisiae, на други по-високоорганизирани еукариоти, докато накрая човекът допълва списъка. Информация за секвенираните геноми може да се получи например на адрес http://www.nslij-genetics.org/seq/.
Освен за изследователски цели секвенирането служи и за диагностика на наследствени болести. Долните два примера са от изследвания на пациенти с болестта на Уилсън, при която мутация в гена ATP7B разстройва медната обмяна. Нормално този ген кодира белтък – мембранен преносител на медни йони. Изследваните болни са хетерозиготи, поради което мутациите водят до видимо наслагване на две последователности.
Секвениране на мутирал участък от гена ATP7B. Стрелка сочи мутацията – субституция на един нуклеотид (missense). Резултатът е любезно предоставен от Теодор Тодоров от Лабораторията по молекулярна патология към Медицинския университет – София.
Секвениране на мутирал участък от гена ATP7B. Стрелка сочи мутацията – инсерция на един нуклеотид (frameshift). Резултатът е любезно предоставен от Теодор Тодоров от Лабораторията по молекулярна патология към Медицинския университет – София.
8. Получаване на клонирана последователност в чист вид
По-горе споменахме, че след като веднъж клонираме дадена последователност, по-късно при нужда лесно можем да я извадим от вектора, в който сме я клонирали, и да я получим в чист вид. Ето как става това:
Пречистеният фрагмент може да се бележи и на свой ред да се използва като сонда при нови изследвания. Например можем да локализираме неговата последователност в ядро или метафазни хромозоми чрез хибридизация in situ.
9. РНК-блот
Ако клонираме ген и получим от него сонда, с нея можем не само да локализираме гена, а и да установим в кои тъкани той е активен. Това значи да намерим кои тъкани съдържат РНК-транскрипти от този ген. Вземаме проби от няколко "заподозрени" тъкани и извличаме РНК от тях. Получаването на РНК в чист вид е по-трудно, отколкото на ДНК. РНК е химично по-нестабилен полимер и, което е по-важно, РНазите са много по-разпространени ензими от ДНазите. Все пак са разработени надеждни методи за получаване на РНК, чиста от белтъци и ДНК и не много хидролизирана.
Работата с РНК все пак има и едно предимство пред тази с ДНК. Докато при ДНК трябва да се въвеждат стандартни краища с рестриктази, РНК-веригите поначало имат определено начало и край и са сравнително къси. Затова ендонуклеазна обработка не се провежда.
Пречистената РНК се подлага на електрофореза и капилярен пренос върху хартия (този път не нитроцелулозна, а друга специална хартия). Клонираният и белязан фрагмент се използва като сонда за хибридизация и белегът се визуализира. С други думи, с РНК се постъпва като с ДНК при Садърн-блота. Фамилията Southern съвпада с английската дума "южен". Изследователите, използвали за други цели идеята на Садърн-блота, на шега са нарекли своите нови блотове на останалите световни посоки. Така описаният метод за търсене на РНК се нарича Northern-блот (букв. от англ. "северен"). Играта на думи е непреводима, затова на български е по-добре да се използва синонимният термин РНК-блот.
По същество разликата между двата блота е, че единият е с ДНК, а другият – с РНК. Ако обаче човек запомни само това като най-важно, след време ще се пита кое трябва да е ДНК или РНК: изследваният материал или сондата. И в двата случая типът на сондата няма значение – използва се ДНК или РНК според това какво има във фризера. За да няма объркване, по-добре е да се запомнят целите на двата метода: със Садърн-блот се търси наличие на ген (ако трябва да бъдем точни, ДНК-последователност), а с РНК-блот (Northern-блот) – експресия на ген.
Ако генът се експресира в някоя от изследваните тъкани, на хартията ще се види ивица. Ако има алтернативно зреене, ще се получат две или повече ивици с различно отместване от старта. Понякога те се съчетават в една тъкан, а друг път са разпределени по различни тъкани.
Схема на РНК-блот може да се види на адрес http://www-bio3d-igbmc.u-strasbg.fr/~ripp/oeuvres/transat/Transat_11092001.htm, а пример за изследване на генна експресия чрез този метод – на адрес http://lsd.ornl.gov/mgd/genomics/Trans-NorthernBlot.htmlx.
Ако пробата съдържа няколко типа клетки и искаме да разберем кои точно експресират гена, можем да проведем хибридизация in situ за РНК. От целия срез белегът ще се открие само в клетките, в които нашият ген се презаписва. Пример за такава хибридизация може да се види на адрес http://www.med.umich.edu/intmed/lyonslab/.
Основни източници
Уотсън Дж., Дж. Тууз, Д. Курц. Рекомбинантна
ДНК. Наука и изкуство, София, 1989.
Delimitreva S., R. Zhivkova, P. Janakiev,
I. Vatev (1999). Pilot models of preimplantation genetic diagnosis by PCR
and FISH in human gametes and cleaving embryos. CR Acad. Bulg. Sci. 52:
107-111.
Powledge T.M. (2004). The polymerase chain
reaction. Advan. Physiol. Edu. 28: 44-50. [Online] http://advan.physiology.org/cgi/content/full/28/2/44
Stratagene 2005-06 Online Catalog http://www.stratagene.com/products/
URL http://www.mayamarkov.com/biology/19Geneng1/19Geneng1.htm
Публикувано 2005
Copyright © Майя Маркова