РЕКОМБИНАЦИЯ НА ДНК. ОБЩА (ХОМОЛОЖНА) РЕКОМБИНАЦИЯ
1. Понятие за рекомбинация. Видове рекомбинация
Ако ДНК осъществяваше само репликация и ексцизионна репарация, съдбата й щеше да бъде предсказуема като събитията от класическата механика. Всяка молекула ДНК, веднъж изучена, щеше неизменно да се открива в този си вид: същите гени с познатите алели в същото взаимно разположение, същите регулаторни участъци, същите повторени последователности, същото начало на репликация. При внимателен оглед биха могли да се открият само отделни точкови мутации.
Обикновено картината е точно такава, но не винаги. Алелите в различните локуси могат да се окажат съчетани по нов начин. Случва се в някои локуси да се открият нови алели, които не биха могли да се получат от старите чрез 1-2 точкови мутации. Може повторената последователност да съдържа повече или по-малко повтори, отколкото е имала преди. Възможно е някои последователности да са разместени. По-рядко се губи ген или група гени, появяват се нови или старите се оказват в двойна доза. От тези наблюдения следва, че понякога молекулите ДНК се ”прекрояват” чрез преместване на големи участъци в същата или в друга молекула ДНК.
Процесът, при който фосфодиестерният скелет на ДНК се скъсва и получените фрагменти се съединяват по нов начин, се нарича рекомбинация.
Редица рекомбинации са предвидени в нормалния живот на клетката. Други представляват мутации и водят до непредвидени и най-често неприятни резултати. Трети, макар и неизгодни за клетката, са изгодни за някой друг. Значението на рекомбинациите е толкова разнообразно, че е трудно да се говори накратко за функциите им. Първичният тип рекомбинация най-вероятно е рекомбинативната репарация. Освен това рекомбинации се използват от родителите за ”изпробване” на нови генни съчетания при половото размножаване, от вирусите за възпроизводство в клетките-гостоприемници, от имунната система за получаване на разнообразни антитела и от патогените за изплъзване от същите тези антитела.
Различават се два основни типа рекомбинация – обща (хомоложна) и сайт-специфична. Обща е рекомбинацията, в която участват много сходни ДНК-последователности. Механизмът на общата рекомбинация включва комплементарно взаимодействие на нуклеотиди по протежение на сравнително дълъг участък. Сайт-специфичната рекомбинация (англ. site – място) не изисква от участниците да си приличат. Нужно е само те да съдържат определени къси нуклеотидни последователности, разпознавани от съответен ензим. С други думи, рекомбинацията бива обща и сайт-специфична според това дали участниците в нея се разпознават сами или ги разпознава ензим.
2. Механизъм на общата рекомбинация
При всички организми общата рекомбинация се отличава с няколко основни черти. Крайният й резултат е, че две хомоложни двойни спирали ДНК обменят участъци. По-нататък навскъде ще говорим за две рекомбиниращи молекули, макар че може да става дума и за два участъка от една и съща молекула.
Мястото на обмяната, където фосфодиестерните връзки се разкъсват и след това се образуват наново, не е точно определено. Всяка достатъчно дълга последователност, която присъства и в двете молекули, може да изпълни тази роля. Механизмът на общата рекомбинация винаги включва образуване на смесена двойна спирала (хетеродуплекс) в мястото на обмяната. Този участък, в който двете изходни молекули ДНК участват с по една верига, може да включва хиляди двойки бази. Именно затова общата рекомбинация изисква хомология поне между някои части от двете двойни спирали. Трябва обаче да се отбележи, че хетеродуплексът допуска известен дял неправилно сдвоени нуклеотиди, а извън него рекомбиниращите ДНК-молекули могат да се различават още повече. Благодарение на комплементарното взаимодействие процесът протича точно: в мястото на обмяната нуклеотиди не се губят и не се добавят.
Всеки акт на рекомбинация изисква разкъсвания в общо 4 ДНК-вериги. В началото на общата рекомбинация обаче е достатъчен един ник. Той позволява в двойната спирала на ДНК да се вмъкне единична верига, освободена от друга двойна спирала. При рекомбинативната репарация никът така и така е налице. При другите типове рекомбинация той трябва да се създаде специално. След това единият свободен край започва да се отделя от комплементарната верига, протягайки се встрани. Хомоложният участък в другата молекула ДНК се денатурира – двете вериги се разтварят, без да се късат. И двата акта на денатурация изискват енергия. Те са необходими, за да може полученият едноверижен ”мустак” да намери своята комплементарна последователност в другата молекула ДНК. Ето схема на тази начална едноверижна обмяна:
При E. coli ключова роля в описаните събития имат белтъците RecBCD и RecA. RecBCD действа като ендонуклеаза, образувайки първичния ник. Мястото не е съвсем случайно – разпознава се последователност от 8 нуклеотида, която се повтаря многократно в генома на E. coli. След това RecBCD действа като хеликаза – движи се по двойната спирала и я разплита за сметка на енергия от АТФ. Така се получава щръкнала единична верига. Схема на функцията на RecBCD e дадена на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1082.
RecA e склонен да се свързва с едноверижна ДНК подобно на белтъците, които стабилизират репликационната вилка. RecA обаче има и втори център за свързване на ДНК. Това позволява на белтъка да задържа заедно едноверижна ДНК и двойна спирала (показано на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1088). Резултатът е сдвояване между комплементарни участъци от две различни молекули ДНК – синапсис.
Хибридизираните вериги се увиват спирално. Хетеродуплексният участък отначало е съвсем къс, но скоро се удължава. Това става, като единичната верига изтиква подобната си от двойната спирала – т. нар. изместване (миграция) на клона. Процесът се подпомага от RecA, както е показано на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1089.
С това приключва най-бавният и труден етап на общата рекомбинация. След това картината става по-симетрична, като в дотогава цялата ДНК-молекула се въвежда втори ник и оттам също се отделя единична верига, която образува хетеродуплекс. Процесът се нарича обмяна с кръстосване на веригите. Полученият при него междинен продукт на рекомбинацията има кръстовидна форма и се нарича хи-структура или структура на Холидей.
След като се образува структурата на Холидей, изместването на клоновете може да продължи синхронно в двете участващи ДНК-молекули, както е показано. Процесът се извършва бързо и без съществен разход на енергия.
Рекомбинацията приключва с още 2 едноверижни скъсвания, които разрушават структурата на Холидей и позволяват на ДНК-молекулите да се разделят. Според това кои ДНК-вериги се късат има 2 възможности – обмяната да се ограничи с къси едноверижни участъци (вляво на схемата) или разкъсаните краища на едната двойна спирала да се присъединят към съответните краища от другата ДНК-спирала (вдясно). Вторият случай е по-важен. Все едно, участниците в рекомбинацията се разделят и остава само да се зашият никовете им.
При пръстенни молекули ДНК актовете на рекомбинация трябва да бъдат четен брой, иначе от два пръстена ще се получи един по-голям.
Както се спомена, при образуването на хетеродуплекса се допуска наличие на некомплементарни нуклеотиди тук-там. Несдвоените участъци или се изглаждат сами при следващата репликация, или се репарират.
Ако се извършва репарация, тя, разбира се, ще е от тип "репарация на несдвояване". Както знаем, при този тип репарация е важно коя от двете ДНК-вериги е по-късно синтезирана. Участниците в общата рекомбинация обаче често са синтезирани по едно и също време. Тогава репаративните белтъци произволно обявяват едната верига за правилна и обработват другата. В резултат едната родителска верига ”се размножава”, а другата се загубва. Такава репарация, при която мястото на обмяната губи хетеродуплексния си характер, се нарича генна конверсия.
Често може да се прочете, че генната конверсия води до неменделово унаследяване. В действителност двете леко различаващи се вериги са равноправни. В една клетка ще бъде утвърден единият алел, в съседната клетка – другият. Изборът е случаен, така че няма защо да очакваме генната конверсия да промени крайното съотношение на алелите.
3. Функции на общата рекомбинация
Общата рекомбинация при всички организми се използва за възстановяване на увредена ДНК след репликацията – рекомбинативна репарация. Резултатът от нея може да се наблюдава в клетъчни култури, обработени с бромдезоксиуридин (BrdU). Това съединение е аналог на тимидина и му прилича достатъчно, за да заблуди ДНК-полимеразата и да се включи в състава на ДНК. Първата репликация след добавянето му дава смесени двойни спирали с една нормална и една ”бромдезоксиуридинова” верига. След митоза и повторна репликация картината ще се промени. Във всяка хромозома едната хроматида ще бъде смесена двойна спирала, а другата хроматида ще бъде изцяло обогатена на BrdU (и двете вериги). Ако се изчака митозата и се направи препарат, двете хроматиди на всяка хромозома поради разликата в състава ще се оцветят различно. Тогава на места ще се видят разменени участъци между хроматидите – резултат от рекомбинативна репарация, протекла между репликацията и началото на митозата.
Визуализиране на обмяната на участъци между сестрински хроматиди чрез включване на BrdU. А. Схема на метода. Б. Миша метафазна пластинка, получена по този начин. Обмяна между сестрински хроматиди се вижда в поне 6 хромозоми. Снимката е любезно предоставена от Петя Нинова от Института по молекулярна биология.
В рекомбинативната репарация могат да участват не само сестринските хроматиди, а и несестринските хроматиди на хромозомите от една хомоложна двойка, макар това да е по-неудобно поради раздалечеността им. Такава обмяна на участъци между хомоложни хромозоми често се нарича соматичен кросинговър, макар че се предприема с цел репарация – съвсем различна от целите на мейотичния кросинговър. Соматичният кросинговър позволява на всяка диплоидна клетка да извършва рекомбинативна репарация дори и преди репликацията. Този резервен механизъм за справяне с тежки ДНК-повреди вероятно обяснява защо организмите с обемисти геноми са диплоидни.
Една наследствена болест при човека – синдромът на Блум, се отличава със силно повишена честота на обмяната между сестрински хроматиди и соматичния кросинговър. Първопричината е мутация в ген за хеликаза, която затруднява удвояването на ДНК. Най-вероятно клетката забелязва нещо нередно, свързано с ДНК, и активира системите си за репарация аналогично на бактериалния SOS-отговор. Те работят усилено, но произволно и без полезен резултат, понеже не могат да отстранят основната причина.
Друга функция на общата рекомбинация е получаването на молекули ДНК, носещи нови алелни съчетания. Тук следва да си спомним бактериалната конюгация (вж. раздел "Репликация – общи особености и основни типове"). При бактериалната конюгация F–-клетката получава част от хромозомата на Hfr-клетката. Резултатът е състояние на т. нар. частична диплоидност. То обаче не се запазва дълго – непълната хромозома в крайна сметка се губи. Преди това обаче тя може да встъпи в хомоложна рекомбинация с хромозомата на гостоприемника. Тогава клетката ще изгуби някои от старите си алели и ще се сдобие с нови на тяхно място. Възможно е новото генно съчетание да е по-добро от старите и да се запази от отбора. Странното при бактериалната конюгация е, че F-факторът, отговорен за провеждането й, като че ли не печели нищо от нея.
При еукариотите картината е много по-чиста. Половото размножаване е на практика повсеместно. То включва преход към хаплоиден стадий чрез мейоза и възстановяване на диплоидното състояние чрез оплождане. По време на мейозата протича обща рекомбинация между хомоложните хромозоми – прекръстосване (кросинговър). Когато се говори за рекомбинация, най-често първо се сещаме за това явление. А всъщност кросинговърът е доста нетипична рекомбинация поради образуването на сложни белтъчни структури и силната спирализация на участващите ДНК-молекули. Затова ще разгледаме прекръстосването отделно заедно с цялата мейоза.
4. Неравен кросинговър в областите, съдържащи тандемни повтори
Както се спомена по-горе, общата рекомбинация по правило протича много точно. Опасността от грешки обаче е сравнително голяма в областите на тандемно повторени последователности. Причината е, че в тези места синапсис може да се осъществи и при донякъде приплъзнати една спрямо друга ДНК-молекули. Ако в изместения участък протече рекомбинация, едната двойна спирала ще се сдобие с повече копия на повтора (дупликация), а другата ще остане с по-малко (делеция). Явлението се нарича неравен кросинговър.
Възможно е естественият отбор да предпочете по-големия брой повтори. Ако това се случи неколкократно, няколкото изходни копия могат да се ”размножат”. Най-вероятно така са еволюирали семействата повторени гени, например хистоновите и тези за рРНК. След като изходният ген се размножи, може в получените копия да се трупат точкови мутации. Ще се получи семейство от подобни, но не еднакви гени. Такива са гените за вариабилните вериги на имуноглобулините, за глобиновите вериги и др. Може да се размножават не само цели гени, а и екзони на един ген. Днешните гени и белтъци говорят за протичане на такива процеси в миналото. Например имуноглобулините са съставени от няколко домена с подобна структура, като всеки домен се кодира от по един екзон.
Неравният кросинговър обаче не е опит за изпробване на нови възможности, а погрешна рекомбинация, която може да има тежки последици. Глобиновите гени са няколко и си приличат, но не са взаимозаменими. Наследствената болест таласемия е резултат от делеция на един от тях при неравен кросинговър.
Ако тандемните повтори не кодират нищо (както е обикновено), неравният кросинговър най-често минава незабелязан. Някои тандемни повтори са го претърпели толкова пъти, че в човешката популация е извънредно трудно да се намерят неродствени индивиди с равен брой копия. Тези повторени участъци се наричат хипервариабилни минисателити. Дължината им днес се използва в съдебната медицина за идентифициране и за установяване на родство. Поради аналогията с пръстовите отпечатъци това се нарича вземане на ДНК-отпечатъци. За да не навлизаме в подробностите на метода, тук ще кажем само, че минисателитните ДНК-участъци се разделят чрез електрофореза в гел, оцветяват се и така дават набор от ивици, уникален за изследвания индивид. Резултат от изследване за бащинство по този начин може да се види на http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/forenspt.html.
Основни източници
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London, 1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell (основен източник)
Ellis N.A., J. Groden, T.-Z. Ye, J. Straughen, D.J. Lennon, S. Ciocci, M. Proytcheva, J. German (1995). The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases. Cell 83: 655-666.
Lewin B. Genes. John Wiley & Sons Inc., New York, 1983.
Rafferty J.B., S.E. Sedelnikova, D. Hargreaves, P.J. Artymiuk, P.J. Baker, G.J. Sharples, A.A. Mahdi, R.G. Lloyd, D.W. Rice (1996). Crystal structure of DNA recombination protein RuvA and a model for its binding to the Holliday junction. Science 274: 415-421.
URL http://www.mayamarkov.com/biology/15Recombin1/15Recombin1.htm
Публикувано 2003
Внесени промени 2004
Copyright © Майя Маркова