РЕПЛИКАЦИЯ (УДВОЯВАНЕ) НА ДНК – МЕХАНИЗЪМ
1. Участници в репликацията
След като в предишния раздел разгледахме репликацията накратко, сега ще се спрем по-подробно на механизма й и молекулите, които я осъществяват. Описанието се отнася както за прокариотите (най-вече E. coli), така и за еукариотното ядро, макар че имаме известно пристрастие към еукариотите като към роднини.
1.1. Топоизомерази
Преди да продължим с разглеждането на репликацията, трябва да споменем една група участници в нея, които въпреки важната си роля остават встрани и в сянка. Това са топоизомеразите. Всички молекули ДНК освен някои от най-малките се нуждаят от топоизомеразна активност през цялата репликация. Първо, поради спиралната структура на ДНК разделянето на двете вериги се възпрепятства от възникващото напрежение на усукване. Всеки, който се е опитвал да разплете шнур от две усукани върви чрез дърпане на краищата им, ще се сети за какво става дума. Топоизомеразите свалят това напрежение.
Второ, репликацията на пръстенните молекули ДНК дава скачени пръстени (катенани) – пъхнати един в друг като халки от синджир. Това също се моделира лесно, като двойно усукан книжен пръстен се разреже надлъжно. Топоизомеразите разделят скачените дъщерни молекули.
Тъй като усукването се предава ефективно по дължината на ДНК, топоизомеразите не са част от реплизомата. Те си вършат работата от разстояние и не се набиват в очи.
1.2. Начала и инициатори
Начало на репликация наричаме всеки ДНК-участък, от който репликацията може да започне (да се инициира). На схемите началата често се означават с ori (от лат. origo, англ. origin – начало). Очевидно всяка молекула ДНК трябва да съдържа поне едно начало. Участъкът, който се реплицира под контрола на едно начало, се нарича репликон. ДНК-молекулата, когато е малка, цялата представлява един репликон, а когато е по-голяма (еукариотна хромозома), се състои от десетки или стотици репликони.
Започне ли репликация в началото, тя не може да спре и продължава, докато обхване целия репликон. С други думи, удвояването се регулира изцяло на етап инициация.
Началата на репликация са изучавани старателно, и то не само от научно любопитство, а и поради важността им за генното инженерство. Изненадващо е, че те не са между най-консервативните ДНК-последователности. Често се оказват специфични за вида и не действат, ако бъдат вкарани в друг организъм, дори той да е сравнително близкородствен. Нещо повече, в една клетка различните молекули ДНК имат разнообразни начала. При E. coli началото на хромозомата не прилича на плазмидните начала, а фагите използват съвсем отделни начала, и то специфични за всяка група фаги. Това разнообразие отчасти отразява регулацията на репликацията: бактериалната хромозома е в 1-2 копия на клетка, плазмидите – в няколко, а фагите – в много. Още по-голямо е разнообразието на начала в еукариотния геном. Все пак повечето изучени начала си приличат по това, че са сравнително дълги палиндроми, богати на А и Т.
Репликонът според случая е или цяла молекула ДНК, или част от нея. Малките молекули ДНК, независимо дали са прокариотни или еукариотни, представляват цялостни репликони. В този случай ДНК-молекулата (единица за сегрегация) съвпада с репликона (единица за репликация).
Бактериалната хромозома също е един репликон и има само едно начало на репликация. При E. coli то е добре изучено и се означава с ori C. Означенията на някои молекули-участници в репликацията са дадени в таблицата повече за евентуална справка, отколкото за запомняне.
Белтъкът, който разпознава началото и се свързва с него, за да може репликацията да започне, се нарича инициатор. При E. coli той означава с DnaA. Освен инициатора още редица белтъци, участващи в репликацията на E. coli, се дават като Dna и латинска буква. Тези означения припомнят метода, използван за изследването на репликацията (а и други жизнени процеси). За да се проучи даден процес, добре е да се издирят мутанти, които не могат да го осъществяват. Мутантна клетка, която не може да се реплицира, обаче ще остане една на брой и няма да се забележи, докато е жива. Изходът са т. нар. температуро-чувствителни мутанти. Техните засегнати белтъци не губят функцията си, а само са по-нестабилни и се инактивират при сравнително слабо загряване. В близкото минало усърдно са били търсени мутантни E. coli, чиято репликация върви при 20-25 градуса, но спира при 42 градуса. Картираните с този подход гени са означавани с dna, а продуктите им – с Dna (от англ. DNA – ДНК).
Еукариотните хромозоми за разлика от бактериалните съдържат много начала на репликация. Така хромозомата може да се реплицира бързо, колкото и да е дълга. Електронно-микроскопска снимка на няколко начала върху една хромозома е дадена на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=replication&rid=cell.figgrp.1674.
Дрождените начала на репликация ARS са сравнително добре изучени, но за жалост са видово-специфични и това ограничава приложението им в генното инженерство.
Ако разсъждаваме какво е нужно на една молекула ДНК, за да бъде хромозома, ще посочим 1 центромера, 2 теломери и поне 1 начало. (Разбира се, за да има функция, хромозомата трябва да съдържа и поне един ген, но това е друг въпрос.) Доколкото при дрождите освен ARS са изследвани и центромерите и теломерите, направен е опит от тях да се сглоби хромозома и да се вкара в дрождената клетка. Оказало се е, че има още една особеност – твърде късите хромозоми лесно се губят от клетката. Минималната допустима дължина е 20-50 килобази. Доколкото е технически възможно молекулата ДНК да се "понапълни", генното инженерство при дрожди отдавна включва създаване и въвеждане в клетката на изкуствени хромозоми.
При по-напредналите еукариоти нещата са по-неясни. Специално при многоклетъчните животни изглежда, че репликацията се инициира в доста широки области, като различни точки от дадената област могат да бъдат начални. Още по-лошо е, че тези големи "начала" имат най-различна последователност и още не е открито нищо общо между тях. В тази каша единственото основание за оптимизъм е, че животинските инициатори много приличат на дрождения ORC. Изобщо инициаторите са по-консервативни от началата.
1.3. Натоварване на хеликазата
За да започне репликацията, до инициатора трябва да се настани хеликазата. Тя обаче не може да се справи сама и се нуждае от помощник, наречен натоварващ фактор. Този белтък, неспоменаван от нас досега, е извънредно важен регулатор. От него зависи дали репликацията ще започне или не. Инициаторът седи върху началото през цялото време, но е пасивен – като листче, отбелязващо важно място в книга. Хеликазата през цялото време плува наоколо, но сама не може да намери инициатора. Натоварващият фактор "подръка" с хеликазата се свързва с инициатора и така отключва събитията. "Книгата е отворена", репликацията ще се състои. Можем да кажем (макар и опростено), че контролът върху репликацията е просто контрол на наличието или/и активността на натоварващия фактор.
Натоварване на хеликазата. По Newlon (1997), опростено и с малки изменения.
1.4. Хеликаза
Хеликаза наричаме белтъка, който разделя двете вериги на ДНК-матрицата. Докато при транскрипцията веригите се разделят временно и в малък участък, репликацията изисква трайно надлъжно разцепване на цялата молекула ДНК. Макар че връзките между двете вериги са слаби (водородни и хидрофобни), поради огромния им брой сумарната им енергия е значителна. Затова хеликазата се нуждае от енергия и може да напредва по двойната спирала само ако хидролизира АТФ.
Окончанието -аза донякъде подвежда: разкъсването на водородните връзки не е химична реакция. По функцията си хеликазата донякъде напомня двигателните белтъци от цитоскелета и като тях няма друга ензимна активност освен АТФ-азната.
Хеликазата на E. coli се означава с DnaB. Тя е доста добре изучена. Представлява хексамер – комплекс от 6 полипептидни вериги. Те се свързват в пръстен, като заграждат матрицата на изоставащата верига. Ясно е, че пръстенът може да се придвижва напред само като разделя двете вериги ДНК.
Еукариотната репликативна хеликаза по сегашни данни е комплекс от белтъци, означавани с МСМ. Името е съкращение от англ. mini-chromosome maintenance, доколкото тези белтъци са необходими за запазването на изкуствени “мини-хромозоми”, получени чрез генно инженерство. MCM, изглежда, също образуват пръстен-хексамер.
Строго погледнато, трябва да наричаме тези хеликази с по-дълго име - репликативни хеликази, доколкото има и други. И у прокариотите, и у еукариотите са открити хеликази, които не създават репликационни вилки, а участват в репарацията, рекомбинацията или транскрипцията. Неотдавна бяха получени неочаквани данни, че две човешки наследствени болести, синдром на Блум и преждевременно стареене, се дължат на мутации в гени за хеликази.
Синдромът на Блум се унаследява автозомно-рецесивно. Болните имат нисък ръст, светлочувствителна лицева еритема, имунна недостатъчност, понижена плодовитост и предразположение към разнообразни типове рак. Хромозомите са нестабилни, което най-удобно се наблюдава в култивирани извън организма клетки.
Преждевременното стареене (синдром на Вернер) също е автозомно-рецесивна болест. До юношеска възраст засегнатите изглеждат нормално. От около 20-годишна възраст обаче у тях се появяват редица белези на остаряване: косата им побелява, кожата им се сбръчква, а зрението им се уврежда от катаракта. С времето те развиват рак, сърдечни болести и още редица болести, характерни за напредналата възраст. Повечето умират, преди да навършат 50 години. Описание на синдрома и снимка на болна от синдрома на Вернер могат да се намерят на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=gnd.section.188
Точните патогенетични механизми на тези болести засега не са известни. Установени са обаче гените, засегнати от мутации. Първичната структура на тези гени е разчетена и сравнена с досега получените генни последователности, за да се види дали прилича на нещо вече известно. Оказало се е, че и при двете болести мутиралите гени са подобни на някои по-рано изучени гени за хеликази. Доколкото белтъците с много подобна структура изпълняват и подобни функции, можем да заключим, че гените за синдрома на Блум и синдрома на Вернер също кодират хеликази.
Засега не е ясно в кой процес участват дефектните хеликази, но очевидно никоя от тях не е репликативната хеликаза, иначе хомозиготните мутанти щяха да загиват още като ранни зародиши. Явно еукариотният организъм има редица хеликази с донякъде разграничени сфери на действие.
1.5. Праймази
Праймаза наричаме полимеразата, която синтезира праймера (зародиша), т.е. началния отрязък на новата ДНК-верига, който се състои от рибонуклеотиди и впоследствие се разгражда. Праймазите рязко се отличават от ДНК-полимеразите по способността си да започват синтезата на нови полинуклеотидни вериги. Праймазата е полимераза-"пионер", която може да греши, но работи в обстановка, в която ДНК-полимеразата от страх да не сбърка просто не се захваща с нищо.
Веднъж заложила основите на новата верига, праймазата се оттегля. Тя е пригодена да синтезира къси вериги или, по-официално казано, има ниска постъпателност.
От досегашното описание може да се помисли, че праймазата е вид РНК-полимераза. Нещата не стоят точно така. Докато другите полимерази са или ДНК-, или РНК-, за праймазата е все едно дали работи с рибо- или с дезоксирибонуклеотиди. Рибонуклеотидите обаче са в много по-голямо количество, затова и праймерът се изгражда от тях.
Праймазата на E. coli се състои от една полипептидна верига и синтезира праймери, дълги десетина нуклеотида.
При еукариотите положението е по-сложно. Еукариотната праймаза е една субединица от голям белтъчен комплекс, който има и субединици с ДНК-полимеразна активност. Заради тях целият белтък се нарича ДНК-полимераза алфа или pol alpha. След като праймазната част на ДНК-полимераза алфа синтезира къс РНК-праймер, ДНК-полимеразната му част продължава веригата с дезоксинуклеотиди. Така се получава смесен РНК-ДНК-праймер, дълъг около 300 нуклеотида. Той не се удължава повече, понеже ДНК-полимераза алфа има сравнително ниска постъпателност.
1.6. ДНК-полимерази
ДНК-зависима ДНК-полимераза (за по-кратко ДНК-полимераза) наричаме ензим, който свързва с фосфодиестерни връзки дезоксинуклеотиди, присъединили се комплементарно към ДНК-матрица.
ДНК-полимеразите в клетката подобно на хеликазите са повече от една. Тази, която действително осъществява репликацията, се нарича репликативна полимераза или репликаза.
E. coli има три ДНК-полимерази. Репликазата се означава като ДНК-полимераза III (или накратко pol III), защото е открита последна. Доста е сложна – изградена е от 10 различни субединици, повечето от които участват с по 2 копия. Такива белтъци, съставени от много субединици със слаби връзки помежду им, често се наричат холоензими. Структурата и функциите на pol III са доста добре изучени, но няма да се спираме на тях подробно.
Три от субединиците на ДНК-полимераза III се обединяват под името сърцевинна полимераза, защото носят ензимните активности – полимеразна и редакторска. Репликационната вилка съдържа две сърцевинни полимерази – една за водещата и една за изоставащата верига. Те са съвсем сближени, заставяйки матрицата на изоставащата верига да се извие като примка. Така се съгласува синтезата на двете нови вериги ДНК.
Свързването на двете сърцевинни полимерази се осигурява с посредничеството на една от другите субединици на pol III. Всяка от сърцевинните полимерази се свързва с по една молекула на тази субединица и двете молекули се свързват помежду си в димер.
Еукариотната клетка може да се похвали с още повече ДНК-полимерази от бактериалната. Вече познаваме една от тях – ДНК-полимераза алфа. Тя обаче не е репликазата. Не би могла и да бъде, понеже няма редакторска активност и не е нагодена за синтеза на дълги вериги.
В еукариотното ядро като репликази се използват две ДНК-полимерази – делта и епсилон. Всеки от тях приблизително съответства на сърцевинната полимераза на E. coli. Точните им роли в репликацията in vivo още не са съвсем изяснени, но изглежда, че единият ензим отговаря за водещата, а другият – за изоставащата верига. Полимеразите на двете вериги са свързани и действат съгласувано. Така че горната рисунка е валидна и за еукариотите, макар че свързващият полипептид тук още не е идентифициран със сигурност.
Всички репликази имат висока постъпателност, за която отговарят специални субединици. Зад каталитичната ("сърцевинна") част на ензима се разполага т. нар. подвижна скоба. Тя има вида на пръстен, който загражда двойната спирала и така закрепя цялата ДНК-полимераза върху субстрата й.
При еукариотите белтъкът, изграждащ подвижната скоба, е известен доста отдавна и дори има известно практическо приложение. Нарича се ядрен антиген на делящите се клетки, съкр. PCNA (от англ. proliferating cell nuclear antigen). Антитела срещу него се използват при някои цитохимични изследвания на тумори. Освен да осигурява постъпателност на репликазата, PCNA има и друга функция. С него при гръбначните животни се свързва основната "поддържаща" метилаза. Ако в родителската ДНК-верига цитозинът в някоя двойка ЦГ е метилиран, поддържащата метилаза има грижата да метилира срещуположния цитозин в новосинтезираната верига. Благодарение на този ензим регулацията на генната експресия чрез метилиране се предава автоматично на дъщерните молекули. PCNA служи за метилазата като белег за участъците, в които се синтезира ДНК.
Подвижната скоба трябва да бъде отворена в началото на синтезата, за да може да се настани върху хибрида матрица-праймер. В края на синтезата, когато се достигне гърбът (5’-краят) на вече синтезиран фрагмент, скобата отново трябва да се отвори, за да се откачи ензимът от субстрата. Скобата е надмолекулен комплекс – състои се от 2 полипептида при прокариотите и 3 при еукариотите. Те могат да се разместват помежду си, образувайки според случая отворена скоба или пръстен.
За слагането на скобата върху ДНК и махането й оттам отговаря специална субединица (или комплекс от субединици) на ДНК-полимеразата. Нарича се "прикрепител на скобата". На двете вериги (водеща и изоставаща) се полага един прикрепител на скобата. На водещата верига той всъщност има съвсем малко работа – само при инициацията и в края на репликона. Върху изоставащата верига обаче подвижната скоба трябва да се наглася наново за всеки фрагмент на Оказаки. Модел на този процес е показан на долната схема.
Поведение на скобата и прикрепителя й при синтезата на изоставащата верига. Повечето участници в репликацията не са означени. Опростено и с изменения по Herendeen & Kelly (1996).
Освен репликазата внимание заслужават и някои от другите ДНК-полимерази. Репликазата все пак е специализирана ДНК-полимераза, пригодена за синтеза на дълги вериги и работеща най-добре като димер във вилка. Понякога обаче трябва да се запълни малка дупка в едната верига ДНК, например когато даден участък бъде повреден и трябва да се поправи (репарира). За такива случаи клетката се нуждае от ензим с ниска постъпателност, приспособен да работи само с една матрична верига.
Първата открита ДНК-полимераза е именно от този тип. Това е ДНК-полимераза I (pol I) на E. coli, важен участник в репарацията на повредена ДНК. Неин функционален аналог в еукариотното ядро е т. нар. ДНК-полимераза бета.
Макар да не е репликаза, ДНК-полимераза І участва и в репликацията. Тя запълва с ДНК местата на РНК-праймерите. Не се включва в реплизомата, а действа зад репликационната вилка.
Митохондриалната ДНК на еукариотите се реплицира от специален ензим – ДНК-полимераза гама. Понеже двете вериги на митохондриалната ДНК се удвояват поотделно, тази ДНК-полимераза не прилича на другите репликази, а е по-скоро от типа на pol I.
1.7. Белтъци, свързващи едноверижна ДНК
Изграждането на фрагментите на Оказаки отзад напред оголва дълги участъци от матрицата за известно време. Ако такава едноверижна ДНК се остави сама на себе си, тя би могла да образува бримки или да се сдвои с друга едноверижна нуклеинова киселина, а това би затруднило репликацията. Затова към тези участъци се присъединяват молекули на белтък, свързващ едноверижна ДНК. Те не позволяват на оголената матрица да влиза в нежелани взаимодействия. Същевременно лесно се отделят, когато трябва да дадат път на праймазата или ДНК-полимеразата. Върху другата половина от вилката такива белтъци не са необходими, тъй като ДНК-полимеразата на водещата верига може да следва плътно хеликазата. Впрочем тя това и прави.
На схемите белтъците, свързващи едноверижна ДНК, обикновено се пропускат. С тях схемата от предишния раздел за синтезата на изоставащата верига ще добие следния вид:
1.8. Нуклеази за отстраняване на праймера
След като си е свършил работата, праймерът трябва да се махне с помощта на нуклеаза и да се замести с ДНК. При E. coli един ензим, ДНК-полимераза I, отговаря и за двете. Той има 5’-3’ екзонуклеазна активност, различна от редакторската му 3’-5’ екзонуклеазна активност. (Това се казва ензим – цели 3 активности, една полимеразна и две екзонуклеазни.)
ДНК-полимераза I е способна да разпознае недовършено място в едната ДНК-верига независимо дали там липсват редица нуклеотиди или има само ник. Там, където новосинтезираната ДНК стига до стария праймер, ще има поне ник, ако не и по-голяма дупка. ДНК-mолимераза I се свързва със свободния 3’-край на това място, разгражда праймера пред себе си и удължава ДНК зад себе си. Понеже 5’-3’ екзонуклеазният домен на ензима не различава ДНК от РНК, обикновено той разгражда не само РНК-праймера, а и част от ДНК-веригата, която е негово продължение. Този процес, при който липсващата фосфодиестерна връзка се изтегля в посока 5’–3’, често се нарича ник-транслация (на български "изместване на скъсването").Това обаче не продължава дълго – ДНК-полимераза I има сравнително ниска постъпателност и скоро се отделя от ДНК.
При еукариотите нито една известна ДНК-полимераза няма 5’-3’ екзонуклеазна активност. РНК-праймерите се разграждат от съвсем отделна 5’-3’ екзонуклеаза – РНаза Н (от hybrid, heteroduplex), специализирана за смесени двойни спирали РНК – ДНК.
Всъщност еукариотната репликаза има толкова висока постъпателност, че не се спира, когато достигне 5’-края на предходния фрагмент на Оказаки. Тя продължава известно време да синтезира новата верига зад себе си, избутвайки вече синтезираната верига пред себе си (вж. схемата). Дори ако РНаза Н не е успяла да разгради РНК-праймера, той заедно със съседните ДНК-участъци се оказва изместен във вид на едноверижна “висулка” встрани от двойната спирала. По-късно “висулката” се изрязва от специализираната за такива структури ендонуклеаза FEN1. Така се отстранява целият фрагмент, синтезиран от недостатъчно точния ензим ДНК-полимераза алфа. При този ход на събитията еукариотната репликация не изисква участието на спомагателна ДНК-полимераза, подобна на бактериалната ДНК-полимераза I.
1.9. ДНК-лигаза
Всички ДНК-полимерази могат да добавят към полинуклеотидната верига отделни нуклеотиди, но не и цял фрагмент. Така след заместването на праймера с ДНК във веригата остава ник, който ДНК-полимеразата не може да премахне. Друг ензим, наречен ДНК-лигаза, открива никовете и ги “зашива”, свързвайки допрените фрагменти в една цялаверига.
Както и с хеликазите и полимеразите, еукариотните клетки имат няколко ДНК-лигази, от които само една е специализирана за свързване на фрагментите на Оказаки при репликацията.
2. Общ поглед върху реплизомата
Долната рисунка обобщава ролите на отделните молекули-участници в удвояването на ДНК.
На тази схема за по-просто репликационната вилка е дадена опъната, което налага отделните ензими да се нанесат на разстояние един от друг. В действителност, както знаем, повечето от тях са групирани в многоензимен комплекс – реплизома.
Постоянните елементи на реплизомата са хеликазата и ДНК-полимеразният холоензим. Той включва две сърцевинни полимерази за съгласуваната синтеза на двете вериги. Свързващата субединица, която скачва двете сърцевинни полимерази, осигурява и връзката на цялата ДНК-полимераза с хеликазата. Праймазата се свързва с хеликазата, когато синтезира праймер, а през останалото време е свободна в разтвора наоколо. Ефективността на репликацията до голяма степен се дължи на тясната връзка между отделните белтъци, които я осъществяват.
Долната схема показва сегашните представи за разположението на отделните белтъци в реплизомата. Отнася се за E. coli, но се предполага, че картината при еукариотите е съвсем подобна.
3. Репликация и опаковка на хроматина
Опаковката на еукариотната ядрена ДНК създава допълнителни усложнения при репликацията. Смята се, че по тази причина репликационната вилка напредва около 10 пъти по-бавно, отколкото при прокариотите.
На първо място хетерохроматинът, за да се удвои, силно се деспирализира. Реплициращите се хетерохроматинови области са видимо неотличими от еухроматиновите. Например половият хроматин като микроскопско образувание изчезва по време на репликацията.
Не е достатъчно обаче целият хроматин да се деспирализира до степента, характерна за еухроматина. Трябва хроматиновата нишка да се разхлаби до 10 nm нуклеозомен наниз. Вероятно, както и при транскрипцията, това става отчасти чрез модифициране на хистоните. Сърцевинните хистони остават върху ДНК докрай и се откъсват едва при самото й преминаване през репликационната вилка. Веднага след вилката обаче върху двете нови спирали отново се настаняват хистонови октамери. Някои от тях са същите, които преди това са били свързани с родителската ДНК. Те се разпределят между дъщерните молекули случайно, без да показват предпочитания към едната от тях. Ясно е обаче, че са нужни и нови хистонови октамери, защото ДНК става повече. Затова в еукариотните клетки хистоните се синтезират едновременно с репликацията. Схема на репликацията на ДНК, опакована с хистони, може да се види на http://www.mlamutations.com/replication/replication.html.
4. Въпросът с краищата на линейната ДНК
За репликацията (за разлика от транскрипцията) е важно дали ДНК-молекулата е пръстенна или линейна.Прокариотните молекули ДНК са пръстенни, като се изключат линейните геноми на някои фаги. Сред еукариотите обаче линейната ДНК е по-популярна. Цялата ядрена ДНК се състои от линейни молекули (хромозомите). Редица еукариотни вируси също са линейни.
Пръстенните молекули се реплицират цялостно без усложнения. При линейната ДНК обаче 5’-крайните части създават проблем. В хода на синтезата те се падат в началото. Дори ако праймазата е способна да започва от самия 5’-край, при репликацията ще се получат молекули, по-къси от изходната. Причината е, че крайният праймер след разграждането си не може да бъде заменен с ДНК. Очевидно са нужни мерки, за да не се стопи молекулата след няколко репликации.
Някои вируси с линейна ДНК решават въпроса много просто: специален белтък замества праймера и остава свързан с 5’-края на готовата верига. Този начин не се използва от клетката въпреки изобилието от ДНК-свързващи белтъци в ядрото.
Други вируси и фаги с линейни ДНК се справят чрез извиване на едноверижен край като фиба или чрез рекомбинация. Няма да разглеждаме тези решения; те също не са популярни в еукариотното ядро.
Начинът, който използват еукариотните хромозоми, се основава на техните теломери. Както знаем, теломерните последователности представляват многократни повторения на къс олигонуклеотид, като преди репликацията 3’-краят е с едно повторение по-дълъг. Последният олигонуклеотид там виси едноверижен (вж. раздел "Организация на наследствения материал при еукариотите"). Затова репликацията всъщност е проблем не на изоставащата, а на водещата верига, (т.е. не на 5’-края, а на 3’-края. Единият 3’-край на всяка дъщерна молекула при репликацията се оказва подравнен с 5’-края на комплементарната верига.
Липсващите ”висулки” се добавят от специален ензим – теломераза. Той съдържа като кофактор РНК-верига и може да синтезира единичната теломерна последователност без матрица. (По-точно казано, без друга матрица освен самия кофактор.) Теломеразата може да се смята за вид обратна транскриптаза и всъщност по структура прилича на другите обратни транскриптази. Сега става ясно защо теломерите се състоят от много къса (5-6 нуклеотида) повторена последователност. По-дълъг олигонуклеотид би затруднил ензима.
Експресията на теломеразния ген е един от начините да се контролират деленията в многоклетъчния организъм. Отдавна е известно, че след изваждане от организма бозайниковите клетки се делят 30-50 пъти, след което престават да се делят. Изследванията на хромозомите на тези клетки показват, че теломерите им се скъсяват с течение на времето. Когато от теломерите остане малко, в клетките се задейства регулативен механизъм, който за нищо на света не им позволява да навлязат в следваща митоза. Такива клетки се наричат остарели.
Клетките от половия път съдържат теломераза, докато нормалните соматични клетки не я притежават в откриваемо количество. На много малко соматични клетки би се наложило да се делят толкова пъти, че да изчерпят теломерите си. Липсата на теломераза позволява на клетката да се раздели няколко пъти и същевременно я предпазва от изкушението да се дели неограничено. За съжаление раковите клетки преодоляват този контролен механизъм. Те "се научават" да експресират теломеразния ген и в тях ензимът се открива. Съответно раковите клетки могат да се поддържат в култура неограничено време.
Едва ли теломеразата е единственият фактор, от който зависи съдбата на клетъчните култури. Но дори и за стареенето на първичните култури от нормални клетки да няма друга причина, тази би била достатъчна.
Основни източници
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts,
J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing
Inc., New York, London, 1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
Baker T.A., S.P. Bell (1998). Polymerases and
the replisome: machines within machines. Cell 92: 295-305.
Baylin S.B. (1997). Tying it all together: epigenetics,
genetics, cell cycle, and cancer. Science 277: 1948-1949.
Clive D. (2002). Replication: radial loop chromosome
model. [Online] http://www.mlamutations.com/replication/replication.html
Herendeen D.R., T.J. Kelly (1996). DNA polymerase
III: Running rings around the fork. Cell 84: 5-8.
Lewin B. Genes. John Wiley & Sons Inc., New
York, 1983.
Nakamura T.M., T.R. Cech (1998). Reversing time:
origin of telomerase. Cell 92: 587-590.
Newlon C.S. (1997). Putting it all together:
building a prereplicative complex. Cell 91: 717-720.
Pennisi E. (1996). Premature aging gene discovered.
Science 272: 193-194.
Yuzhakov A., J. Turner, M. O’Donnell (1996).
Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading
and lagging strand replication. Cell 86: 877-886.
URL http://www.mayamarkov.com/biology/13Replicat2/13Replicat2.htm
Публикувано 2003
Copyright © Майя Маркова