ТРАНСЛАЦИЯ (ПРЕВЕЖДАНЕ) – МЕХАНИЗЪМ И КОНТРОЛ
1. Общи черти на транслацията
Както и презаписването, превеждането протича на 3 етапа – инициация, елонгация и терминация.
1.1. Инициация
Във вида, показан на схемите от предишния раздел, рибозомата е неактивна. При инициацията (започването) на белтъчната синтеза двете субединици трябва да се разделят. Това се осигурява от инициаторни фактори. Те при прокариотите се означават с IF (initiation factor) и номер, а при еукариотите – с eIF и номер (е означава “еукариотен”). Някои от инициаторните фактори се свързват с малката субединица и я карат да се откъсне от голямата.
Когато рибозомата започне синтеза на нов полипептид веднага след като е изградила предишния, инициацията протича още по-лесно. В този случай двете субединици са разделени и факторите трябва само да се свържат с малката субединица.
След това с помощта на присъединените инициаторни фактори малката субединица свързва мРНК и първата аминоацил-тРНК. Тяхната съвкупност се нарича начален (инициаторен) комплекс.
5’-краят на мРНК е ”преден” не само при синтезата, а и при превеждането й. Той се разпознава от рибозомата и се свързва с нея. Недалеч от него се намира първият транслиран кодон АУГ.
АУГ е единствен кодон за метионин и се среща и по-нататък в мРНК всеки път, когато в полипептида трябва да се включи тази аминокиселина. Във вътрешността на веригата обаче с АУГ се свързва друга тРНК. Дори и в най-икономичните генетични системи е предвидена специална инициаторна (начална) тРНК за метионин, която се свързва само с началния кодон. Един от инициаторните фактори, IF-2 при прокариотите и eIF-2 при еукариотите, измежду всички аминоацил-тРНК разпознава само началната метионил-тРНК. Той се свързва с нея и й помага да се настани в пептидилния участък (а не в аминоацилния, където по-късно ще постъпват останалите аминоацил-тРНК).
След като малката субединица се свърже с мРНК и с началната тРНК, инициаторните фактори напускат. Към началния комплекс се присъединява голямата субединица и се получава активна рибозома. С това инициацията завършва. Синтезата продължава, все едно в П-участъка вече е закачен цял пептид, а не само един метионин.
1.2. Елонгация
Елонгацията (удължаването) представлява белтъчната синтеза по същество. Присъединяването на всяка нова аминокиселина започва с влизане на нейната аминоацил-тРНК в А-участъка. С тРНК е свързан един елонгационен фактор, който има сродство към всички аминоацил-тРНК освен началната. За да не въвеждаме означението му, състоящо се от EF (elongation factor; при еукариотите eEF) и буква или номер, можем да го наричаме “транспортен фактор”. Той помага на аминоацил-тРНК да влезе, но не й позволява да се намести добре в аминоацилния участък. Функцията му е донякъде аналогична на тази на IF-2 (eIF-2) при инициацията.
Тъй като молекулите не могат да се разпознават отдалеч, правилната аминоацил-тРНК се открива по метода на пробите и грешките. Около рибозомата плуват всички аминоацил-тРНК. Някоя от тях улучва А-участъка. Ако антикодонът й не пасне на наличния кодон, тя се изтиква обратно навън заедно с транспортния фактор и се изчаква следващият опит. При 20 аминокиселини и още повече тРНК процедурата изглежда безнадеждна, но всъщност елонгацията е най-бързият етап на белтъчната синтеза.
Ако обаче антикодонът на аминоацил-тРНК се окаже комплементарен на кодона, образуваните водородни връзки я задържат на място. Тогава съпровождащият я транспортен фактор се откъсва от нея и напуска рибозомата, хидролизирайки една молекула ГТФ. Това позволява на аминоацил-тРНК да се настани истински в А-участъка.
Когато аминоацил-тРНК “се намести”, аминогрупата на нейната аминокиселина се оказва до активираната СО-група на последната аминокиселина от пептида. Протича пептидил-трансферазната реакция.
След като се образува новата пептидна връзка, рибозомата проявява удивителна гъвкавост. Тя се премества по мРНК в посока 5’ – 3’ с един кодон. Процесът се нарича транслокация. Протичането му се подпомага от елонгационен фактор, наречен транслоказа, който при това хидролизира молекула ГТФ. След транслокацията бившата пептидилна тРНК, която вече не носи нищо, се оказва изместена и напуска. Бившата аминоацил-тРНК, която вече е пептидил-тРНК, попада в пептидилния участък. Аминоацилният участък е празен и готов да приеме нова аминоацил-тРНК. Всичко е както в началото на описанието с тази разлика, че полипептидът е с един остатък по-дълъг.
Виждаме, че за всяка пептидна връзка се жертват две макроергични връзки от ГТФ – една при въвеждането на аминоацил-тРНК и една при транслокацията. Към тази равносметка следва да добавим и връзката (всъщност двете връзки), взети от АТФ за активиране на аминокиселината. Сложността и точността на транслацията не са безплатни.
Понякога се спори дали рибозомата се мести по мРНК или мРНК – по рибозомата. Ако единият от участниците в транслокацията е закрепен за някаква по-голяма структура (например рибозомата – за ендоплазмената мрежа), по-удобно е да приемем него за неподвижен. Иначе от механиката знаем, че можем да говорим за движение на тяло спрямо друго тяло, но не и за абсолютно движение и покой. Така че можем да решим въпроса по свой избор.
Една молекула мРНК може да се транслира
многократно. Не е нужно да се чака първата рибозома да завърши своя полипептид.
Щом първата елонгация напредне донякъде и 5’-краят на мРНК се освободи,
с него може да се свърже втора рибозома, а след малко – и трета. Образува
се комплекс – полирибозома, който синтезира
един и същ белтък с много малка разлика във времето. Снимка на полизома
може да се види например на http://www.nobel.se/medicine/educational/dna/a/translation/polysome_em.html
и
http://cellbio.utmb.edu/cellbio/ribosome.htm.
Ефективното използване на мРНК позволява всеки белтък да се натрупва в клетката много бързо, дори и генът му да е представен в генома само с един екземпляр. И наистина гените за белтъци са в 1 или 2 копия. (Рядко изключение са хистоновите гени, които са повторени.) Обратно, гените за рРНК са размножени в десетки копия, тъй като каквото се получи при транскрипцията – това си остава.
1.3. Терминация
Елонгацията продължава, докато в А-участъка попадне някой от завършващите кодони – УАА, УАГ или УГА. Тогава се пристъпва към терминация (завършване) на белтъчната синтеза. Няма тРНК с антикодон за тези кодони. Затова пък има белтъчни фактори, способни да ги разпознаят и свържат. Това са освобождаващите фактори, означавани с RF (от release factor; при еукариотите eRF) и номер. Наречени са така, понеже освобождават готовата полипептидна верига и рибозомните субединици. Можем да се досетим, че те са се мотаели около рибозомата и заедно с аминоацил-тРНК са си опитвали късмета през цялата елонгация.
За всяка терминация е нужно съвместното действие на два различни освобождаващи фактора. Единият по пространствената си структура прилича на аминоацил-тРНК и именно той разпознава стоп-кодона. Другият наподобява транспортния фактор. Така и при елонгацията, и при терминацията в рибозомата влиза комплекс със сходни размери и форма.
Когато в А-участъка се настанят освобождаващи фактори, активността на пептидилтрансферазата се променя. Ензимът прехвърля пептидилния остатък не върху аминокиселина, каквато и без това няма наблизо, а върху молекула вода. С това СО-групата става СООН и така се оформя въглеродният край на полипептидната верига. Тя е вече свободна и напуска рибозомата. Целият комплекс се разпада – тРНК, мРНК и двете субединици се отделят една от друга, връщайки се в състоянието отпреди инициацията.
2. Особености на транслацията при различните организми
2.1. Прокариоти
В прокариотната клетка ДНК и рибозомите не са разграничени. Още преди мРНК да е синтезирана докрай, към нея се прикрепват рибозоми и транслацията й започва.
Спрягане на транскрипцията и транслацията при прокариотите. От Paustian (2003) с любезното му разрешение.
Прокариотните мРНК съдържат на 4-7 бази разстояние пред началния кодон каноничния хексамер АГГАГГ. Той се нарича Шайн-Далгарнова последователност. 3’-краят на 16S рРНК, разположен доста открито в малката субединица, съдържа комплементарната последователност ЦЦУЦЦУ. При инициацията двата хексамера хибридизират. Това е сигнал за рибозомата да започне синтезата от най-близкия кодон АУГ. Ако АУГ се изгуби, прокариотната рибозома за разлика от еукариотната може да започва и от ГУГ.
Тъй като са преписи от цели оперони, прокариотните мРНК могат да съдържат информация за 2 или повече белтъка. Кодиращият участък за всеки белтък има свой начален кодон и своя Шайн-Далгарнова последователност. Затова рибозомата може да се присъедини не само към 5’-края на мРНК, а и някъде по средата й. Такива мРНК се наричат полицистронни. С тях се образуват големи полирибозоми (най-често с десетки рибозоми). След като завърши един полипептид, рибозомата може да не напусне мРНК, а да ”пропълзи” по нея до следващия инициаторен кодон. Това е възможно, тъй като разстоянието е само няколко нуклеотида.
Прокариотната начална тРНК носи модифицирана аминокиселина – формилметионин. Формилирането става след свързването на тРНК с метионин. Засяга се алфа-аминогрупата, която при първата аминокиселина не е предвидено да участва в пептидна връзка. Химиците при много синтези предварително модифицират неучастващите в реакцията групи, като им закачат ”защитни” остатъци, за да предотвратят странични реакции. Формилният остатък напомня тези защитни групи, но биологичната му роля не е много ясна, доколкото еукариотите и без него синтезират успешно полипептидните си вериги.
2.2. Еукариоти – транслация в цитозола
Инициацията в цитозола на еукариотната клетка протича малко по-различно, отколкото при бактериите. Първият метионин не се формилира. Началната тРНК, която го носи, се присъединява към малката субединица преди мРНК (обратно на прокариотите, при които мРНК се свързва първа). На горната схема за инициацията умишлено е показано едновременно свързване на мРНК и началната тРНК, за да бъде валидна фигурата и за прокариотите, и за еукариотите.
Еукариотните мРНК нямат Шайн-Далгарнова последователност. При това явно я нямат от много отдавна, тъй като и комплементарната последователност в 18S рРНК (хомолог на 16S рРНК) е делетирана. Еукариотните мРНК се разпознават от малката субединица по шапките. След като свърже шапката, 40S-субединицата пълзи по мРНК (понякога десетки нуклеотиди) и хидролизира АТФ, докато достигне кодон АУГ.
Следователно еукариотната инициация придава на 5’-края на мРНК абсолютна важност, каквато липсва при бактериите. Еукариотните мРНК са моноцистронни – рибозомите започват само от едно място и дадената мРНК осигурява синтезата само на един полипептид. Съответно еукариотните полирибозоми средно са по-къси от бактериалните и обикновено включват около 10 рибозоми. Сравнение между прокариотна и еукариотна мРНК може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=mrna&rid=cell.figgrp.1011.
След като се намери кодон АУГ, инициаторните фактори се отделят и голямата субединица се присъединява. Транслацията е инициирана. На етап елонгация и терминация няма съществени разлики между прокариоти и еукариоти.
Законен е въпросът (макар че малцина биха запазили достатъчно съзнание, за да го зададат): Как при тези взискателни малки субединици е бил разчетен генетичният код? Изкуствените мРНК, използвани в историческите опити, са нямали шапки, а обикновено и кодон АУГ. За щастие в тези in vitro системи транслацията е протичала неспецифично, тъй като концентрацията на магнезиеви йони е била много над физиологичната.
2.3. Еукариоти – транслация в органелите
Рибозомите в митохондриите и хлоропластите се различават от тези в цитозола и по-скоро приличат на бактериалните. Освен това органелните мРНК нямат шапки, а началният метионин се формилира като при прокариотите.
Най-голямата изненада, поднесена от митохондриалната генетична система, са вариациите в генетичния код. Още преди да бъде открита странността на микоплазмите, в митохондриите са установени "диалекти", и то различни при различните еукариоти. При бозайниците УГА вместо завършващ е кодон за триптофан (като при микоплазмите); АУА кодира метионин; АГА и АГГ вместо кодони за аргинин са терминални.
По-нататъшните изследвания показват, че разликите опростяват посредничеството на тРНК. Според правилата на люлеенето 61-те кодиращи триплета на стандартния код изискват най-малко 31 антикодона, съответно поне 32 тРНК заедно с началната. Митохондриите на бозайниците минават само с 23 тРНК. От тях 8 разпознават по четири кодона, 14 – по два, а 1 е начална. Модификациите при митохондриите на другите еукариоти, макар и различни, имат същия резултат – намаляване на броя необходими тРНК.
Изглежда, митохондриалните особености на генетичния код не само са вторични, а и са възникнали сравнително късно, след като много митохондриални гени са отпаднали като ненужни, а повечето от останалите са заминали към ядрото. Вероятно само малък геном, кодиращ шепа белтъци, може да си позволи промяна в разчитането не на един, а на няколко кодона. Тази хипотеза за хода на събитията обяснява и защо различните еукариоти имат различни митохондриални кодове – промените са се осъществили след разделянето на основните групи еукариоти.
Икономията на тРНК в крайна сметка е излязла твърде скъпо. След като кодът в митохондриите се е променил, няколкото им гена за белтъци вече едва ли биха могли да се преместят в ядрото. Посланието им не би се разбрало правилно в цитозола. Така клетката се принуждава да поддържа, вероятно завинаги, втората генетична система в митохондриите.
Тази втора генетична система, освен че трябва да се учи, има и други недостатъци. Единият е енергетичната й цена. Вторият, по-сериозен, е нейната уязвимост. Ако всички митохондриални гени се бяха преместили в ядрото, те щяха да се възползват от ядрените механизми за репликация и репарация на ДНК. В митохондриите и репликацията, и репарацията протичат с много по-малка точност. Освен това там ДНК е твърде близо до дихателната верига и се уврежда от свободните радикали, които са страничен продукт на дишането. Затова в митохондриите на тъканите, използващи много кислород (мускули, мозък) с възрастта се натрупват соматични мутации, което нарушава функцията им и допринася за стареенето на организма.
3. Антибиотици и токсини, потискащи белтъчната синтеза
Редица антибиотици атакуват транслацията. Някои от тях действат на всички клетки, докато други са специфични за прокариоти или за еукариоти. Ето част от известните антибиотици, които потискат белтъчната синтеза.
Не всички посочени инхибитори са приложими като лекарства. Тези, които действат включително или изключително върху еукариотни клетки, явно могат да бъдат опасни. По-перспективни са антибиотиците, атакуващи само прокариотната транслация. Трябва обаче да се има предвид, че повечето от тях инхибират белтъчната синтеза и в митохондриите (а също така и в хлоропластите). Обратно, еукариотният инхибитор циклохексимид не засяга органелите. Фактът, че транслацията в органелите е чувствителна към прокариотни, а не към еукариотни инхибитори, се е оказал важен довод в подкрепа на ендосимбионтната теория.
Независимо дали са приложими в медицината, инхибиторите са се оказали ценно средство за изучаване на транслацията. С добавяне на такъв антибиотик в моделна система се установява дали даден процес изисква белтъчна синтеза de novo или използва предварително складирани белтъци. Чрез хлорамфеникол и циклохексимид се изучават отношенията на митохондриите с останалата част на еукариотната клетка.
Накратко ще бъде разгледан механизмът на действие на пуромицина, тъй като си заслужава. Пуромицинът се вмъква в А-участъка веднага след транслокацията, влизайки в ролята на аминоацил-тРНК. Молекулата му наистина прилича на 3’-края на аминоацил-тРНК:
Тъй като неподходящите тРНК се отсяват още на входа на рибозомата, пептидил-трансферазата не оглежда субстрата си подробно. Полипептидът се прехвърля върху аминогрупата на пуромицина. Полученият полипептидил-пуромицин не може да образува следващата пептидна връзка, а и не е закрепен за нищо. Той напуска рибозомата. Ако в клетката има още пуромицин, още белтъчни молекули се получават скъсени и съвършено негодни.
Освен антибиотиците, които са с небелтъчна природа, има и белтъчни токсини, които атакуват транслацията. Те са ензими, които модифицират определени молекули-участници в белтъчната синтеза. Например дифтерийният токсин от бактерията Corynebacterium diphtheriae инактивира еукариотната транслоказа чрез АДФ-рибозилиране, а рицинът от растението Ricinus communis инактивира 28S рРНК чрез откъсване на определени аденинови бази. И двата токсина са смъртоносни за човека в сравнително малки дози.
4. Регулация на транслацията
На равнище транслация при еукариотите има известен контрол на генната експресия.
Първото, на което следва да се обърне внимание, е трайността на мРНК. При бактериите времето на полуживот на всички мРНК е около 3 минути. Това се дължи не на присъща химична нестабилност, а на ензимно разграждане от РНази. Дългото запазване на мРНК би било излишно в късия жизнен цикъл на прокариотите, а и е изгодно за някои РНК-фаги, които използват геномната си РНК и като матрична. Ако някоя конкретна мРНК е нужна за дълго време, винаги може да се синтезира още от нея. Подобно на синтезата и транслацията хидролизата на мРНК също е в посока 5’ – 3’.
При еукариотите мРНК обикновено траят с часове. Освен това отделните мРНК силно се различават по своето време на полуживот. За някои то е 30 минути или дори по-малко, а за други – 6, 12 или 24 часа. Късоживеещите мРНК кодират регулаторни белтъци, нужни само в определен момент. Такива са например растежните фактори и други белтъци, регулиращи клетъчния цикъл. Стабилността не само е различна при различните мРНК, а и при някои от тях се регулира, изменяйки се според условията.
Ключово значение за стабилността на еукариотната мРНК има нетранслираният й 3’-край, т.е. последните нуклеотиди, разположени след стоп-кодона. При прокариотните мРНК този краен участък е къс и не особено интересен. При еукариотите неговата първична структура е сигнал за РНазите как да се отнасят с конкретната мРНК – дали да я разграждат по-бързо или по-бавно. Именно от 3’-края при еукариотните мРНК (за разлика от прокариотните) започва разграждането. Първо се скъсява опашката, а след като тя се свърши, се хидролизира и самата мРНК.
Долната фигура показва животински мРНК с различна трайност. Бета-глобиновата мРНК е стабилна (време на полуживот над 10 часа). мРНК за растежни фактори са нестабилни (полуживот 30 минути). Хистоновите мРНК са нестабилни и зависят от репликацията (полуживот 1 час, ако клетката синтезира ДНК, и няколко минути в отсъствие на ДНК-синтеза). Трите мРНК се различават по нетранслираната си 3’-крайна област. Получени са рекомбинантни молекули с кодираща област от една мРНК и нетранслиран 3’-край от друга. Оказало се е, че 3’-краят е решаващ за стабилността. Подмяната му дава например стабилна мРНК за растежен фактор или глобинова мРНК с нестабилност, зависеща от репликацията. Ако 3’-краят на мРНК за растежен фактор просто се скъси, тя става стабилна. Следователно еукариотната мРНК е поначало стабилна и става нестабилна само ако това е изрично посочено в първичната структура на 3’-края й.
Влияние на нетранслирания 3’-край върху стабилността на някои природни и рекомбинантни мРНК. По Alberts et al. (1994) и Melcher (2001) с малки изменения.
Освен стабилността на мРНК понякога се регулира и самата й транслация. Например мРНК за голям брой белтъци се запасяват като нуклеопротеини в цитоплазмата на животинските яйцеклетки, но не се транслират веднага. С оплождането някои от тези мРНК се вкарват в употреба, а е всеки етап на ембриогенезата се активира нов набор мРНК. Репресирането на мРНК и активирането им в нужния момент се осъществява от свързани с тях белтъци.
При различните животни майчините мРНК отстъпват място на зародишните на различен етап. При много видове това става доста късно и зародишът може да завърши дробенето си и дори да започне гаструлация за сметка само на запасените в яйцето мРНК. При един опит зиготи на морския таралеж Lytechinus са оставени да се развиват в присъствие или на актиномицин D (инхибитор на транскрипцията), или на циклохексимид (инхибитор на транслацията). Зародишите, в които е потисната белтъчната синтеза, остават едноклетъчни – зиготата изобщо не се развива. Зародишите, в които е потисната транскрипцията, обаче успяват да стигнат до стадий бластула, преди развитието им да спре.
При земноводното аксолотъл е открита мутация, означавана с 0, при която зародишният геном така и не започва да се презаписва. Съответно в засегнатите зародиши не може да се синтезира никаква нова РНК. Въпреки това те успяват да се развият до стадий ранна гаструла.
Освен чрез матрицата (мРНК) транслацията при еукариотите се регулира и чрез фактора eIF-2 – единствения инициаторен фактор, който по-горе назовахме поименно. Неговата активност се контролира чрез обратимо фосфорилиране. Дефосфорилираната му форма е активна, а фосфорилираната – неактивна. Ако по някакви причини белтъчната синтеза в клетката трябва да спре, специален ензим, наречен протеинкиназа, фосфорилира eIF-2 и така го инактивира.
Когато вирус проникне в клетка от бозайник, тя обикновено не успява да се защити. Може обаче да предупреди съседните клетки, като синтезира и секретира белтъка интерферон. Навън той се свързва с рецептори по най-близките клетъчни мембрани. Във всяка от тях сигналът за вирусна опасност се предава от клетъчната мембрана във вътрешността на клетката и предизвиква съответна реакция. В резултат се синтезира протеинкиназата, която фосфорилира eIF-2. Той се инактивира и транслацията спира за известно време.
Освен това малко по-късно в същите клетки се активира ендонуклеаза, която нарязва всички мРНК – и клетъчните, и евентуалните вирусни. Така заразената клетка се огражда със санитарен кордон от невъзприемчиви клетки, в които вирусът може да проникне, но не може да продължи развитието си.
В този текст терминът “транспортен фактор” е въведен въз основа на съкращението T (transfer) от EF-Tu.
Основни източници
Марков Г. Тайните на клетката. 3. осн.
прер. изд. Народна просвета, София, 1984.
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular
Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London,
1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
Childs G.V. (1996). Role of the ribosome. [Online] http://cellbio.utmb.edu/cellbio/ribosome.htm
Gilbert S.F. Developmental Biology. 6th Edition. Sinauer Associates,
Inc., Sunderland, USA, 2000. [Online] http://www.devbio.com/
King M.W. (2001). Protein synthesis. [Online] http://www.indstate.edu/thcme/mwking/protein-synthesis.html
Lewin B. Genes. John Wiley & Sons Inc., New York, 1983.
Mathews C.K., K.E. van Holde, K.G. Ahern. Biochemistry. 3rd Edition.
Addison-Wesley Longman, San Francisco, 2000. [Online] http://www.orst.edu/instruction/bb492/lectures/TranslationII.html
Melcher U. (2001). mRNA stability. [Online] http://opbs.okstate.edu/~melcher/mg/MGW2/MG237.html
Nakamura Y., K. Ito, L.A. Isaksson (1996). Emerging understanding of
translation termination. Cell 87: 147-150.
Paustian T. (2003). The genetic regions. http://www.bact.wisc.edu/MicroTextbook/BacterialStructure/DNA.html
Stryer L. Biochemistry. 4th Edition. W.H. Freeman &
Co., New York, 1995.
Corbett S.L. (2002). Ricin: molecular structure and toxic action [Online] http://chiron.valdosta.edu/rgoddard/biol4900/corbett/corbett3.htm
Gabashvili I. (2002). Ribosomal targets for drugs and pathogenes. [Online] http://smi-web.stanford.edu/people/isg/drugs.html
Kimball J.W. (2002). Antibiotics: antibacterial agents. [Online] http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Antibiotics.html
URL http://www.mayamarkov.com/biology/09Translat2/09Translat2.htm
Публикувано 2003
Copyright © Майя Маркова