ТРАНСКРИПЦИЯ И РЕГУЛАЦИЯ НА ТРАНСКРИПЦИЯТА ПРИ ЕУКАРИОТИТЕ
1. Транскрипция в еукариотното ядро
Общо правило е, че жизнените процеси при еукариотите протичат на същия принцип като при прокариотите, но са по-усложнени. Това важи и за транскрипцията.
Докато бактериите презаписват всичките си гени с един ензим, еукариотната клетка има 3 РНК-полимерази само в ядрото си. Те се означават с I, II и III и разпознават различни промотори. РНК-полимераза I синтезира високомолекулните рРНК, II – мРНК и някои малки ядрени РНК, а III – останалите малки РНК (тРНК, 5S рРНК, мяРНК, мцРНК, т.е. малките ядрени и цитоплазмени РНК). Трите РНК-полимерази явно имат общ предшественик: структурата им е близка, а някои от субединиците им са общи.
Освен помежду си трите ядрени РНК-полимерази показват хомология и с бактериалната. И трите еукариотни ензима са по-сложни от прокариотния – състоят се от повече (поне 10) и по-големи субединици. Някои от субединиците обаче наподобяват субединици на бактериалната РНК-полимераза. Съпоставка на бета прим-субединицата на прокариотната РНК-полимераза със съответната субединица на еукариотни РНК-полимерази може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1685.
Промоторите при еукариотите имат далечна прилика с прокариотните. Терминацията на транскрипцията при еукариотите все още не е добре изучена. В еукариотната хромозома няма оперони. Гените са разпръснати и всеки има собствен промотор и терминатор.
На долната снимка се вижда как изглежда транскрипцията под електронен микроскоп. Препаратът е от гени за рРНК, които се презаписват усилено. Картината често се наподобява на коледно дърво. Те транскрипционните единици са много и са подредени тандемно, без да се допират плътно. Растящите транскрипти са "клоните на елхата". Удължаването им показва посоката на презаписване. Черните точки върху ДНК в основата им са молекулите на РНК-полимераза I. По-големите черни точки в края им ("топките на елхата") са вероятно белтъци, участващи в зреенето на рРНК, или може би първите присъединили се рибозомни белтъци. Добре се вижда къде се простира транскрипционната единица: върхът на елхата е началната точка, а мястото, където "клоните" изведнъж свършват – терминаторът.
Презаписвани гени за рРНК под електронен микроскоп. Снимката е любезно предоставена от Ulrich Scheer от Вюрцбургския университет.
Опаковката на ДНК в хроматина създава проблеми, непознати за прокариотите. За да може РНК-полимеразата да работи, трябва ДНК да й бъде достъпна. При транскрипция типичната за строежа на еухроматина 30 nm-нишка се разгъва, а Н1 се отделя от ДНК. Транскрипционната единица остава опакована със сърцевинни хистони във вид на “наниз от мъниста”, но когато РНК-полимеразата достигне хистонов октамер, тя го принуждава да се откъсне от ДНК. После той отново се свързва с двойната спирала. По-долу, когато обсъждаме контрола на генната активност, ще видим по-подробно как структурата на хроматина влияе върху презаписването при еукариотите.
2. Транскрипция в органелите
В митохондриите и хлоропластите работят РНК-полимерази, различни от ядрените и значително по-малки от тях. Трябва да се очаква тези скромни геноми да се презаписват от прости ензими, както е при някои фаги.
В човешкия митохондриален геном има само 2 промотора. (Няма начин да се мине с един, тъй като от 37 гена за 28 матрична е едната верига, а за 9 – другата.) При презаписването се копира цялата верига ДНК. Резултатът са 2 огромни транскрипта, които после се нарязват до отделни РНК.
Двете вериги се презаписват с еднаква скорост. Регулация на транскрипцията в органелите не е установена.
3. Регулация на транскрипцията при еукариотите
Като цяло еукариотната регулация, сравнена с прокариотната, е много по-положителна. В бактериалната клетка основна роля играят репресорите, а без тях повечето оперони са готови за употреба. Останалите оперони изискват един активатор, много рядко два. При еукариотите е обратното: гените поначало са в неактивно състояние, а за да се включи някой от тях, трябват специални усилия.
3.1. Влияние на организацията на хроматина
За да се презаписва ДНК, първото условие е тя да бъде достъпна за молекулите-участници в процеса. Изходната й кондензация не трябва да бъде по-висока, отколкото е в еухроматина. Митотичните хромозоми и хетерохроматинът не са годни за транскрипция. За конститутивния хетерохроматин не може да се очаква презаписване, защото в него и без това няма гени. Ако обаче там попадне ген от друго място, той повече не се транскрибира. Промяната в експресията на даден ген, след като той бъде преместен при мутация или експеримент, се нарича ефект на положението.
"Изключването" на гени чрез плътно опаковане се среща и в нормалния живот на клетката. Големи участъци от ДНК могат да се отстранят от транскрипцията, като се превърнат във факултативен хетерохроматин. Най-известният пример за това е половият хроматин (телцето на Бар) при женските бозайници. Тъй като нормалната женска има 2 Х-хромозоми, а нормалният мъжки – само една, ако не се вземат мерки, продуктите на всички гени от Х-хромозомата биха се получавали двойно повече в женските, отколкото в мъжките. Фактът, че двойната разлика в броя на гените не води до разлика в количеството на белтъците, се означава като дозова компенсация. В животинското царство тя се постига по няколко начина. При бозайниците едната Х-хромозома в соматичните клетки на женската се хетерохроматинизира. Това става доста рано през зародишното развитие. Във всяка клетка хромозомата, която ще се инактивира, се избира измежду двата хомолога случайно, така че женският индивид е мозайка. Неактивната хромозома може да се види в много клетки като малко тъмно петно под ядрената обвивка – т. нар. полов хроматин или телце на Бар.
Телце на Бар в клетки от човешка устна лигавица. А. Клетка от жена – половият хроматин се намира горе в периферията на ядрото. Б. Клетка от мъж – телце на Бар липсва. Около ядрата се виждат бактерии от устната микрофлора.
При повече от две Х-хромозоми всички освен една се превръщат в полов хроматин. Така при кариотип 47,ХХХ в ядрото ще се видят 2 тъмни петна. Изобщо телцата на Бар винаги са с едно по-малко от Х-хромозомите.
Хетерохроматинизацията не е чест механизъм на контрол. Тя може да се използва само за големи части от генома. Регулацията чрез опаковане (и разопаковане) обаче действа и в еухроматина. Основа на неговата структура е 30 nm ДНП-фибрила. Транскрибираните участъци обаче са разхлабени до "наниз от мъниста". Затова и те първи се разграждат при обработка с ендонуклеазата ДНаза I. Това личи от долната таблица.
Чувствителност на определени ДНК-последователности в различни тъкани на кокошка към ДНаза I. Под (–) се разбира "не повече от средностатистическата ДНК".
Тази чувствителна част от хроматина често се означава като активен хроматин. Освен че по-голямата част от Н1 липсва, там се наблюдават ковалентни модификации на хистоните, които “разхлабват” връзката им с ДНК.
Деспирализацията не просто съпровожда презаписването, а е негово предварително необходимо условие. Разгъването предшества транскрипцията по време. Към ДНаза I са чувствителни не само гените, а и областите от двете им страни – т. нар. фланкираща ДНК (flank, англ. – заграждам). Наблюдавани са ларви на Drosophila с мутантен ген, неспособен да се транскрибира. Гигантските им хромозоми образуват съответна пуфа съвсем като у нормалните ларви. Някакви регулаторни системи имат задачата да подготвят този ген за транскрипция и не е тяхна вина, че генът е повреден и трудът им се оказва напразен.
В активния хроматин има определени участъци, където ДНаза I винаги срязва най-напред. Те се наричат места, свърхчувствителни към нуклеази. Причината за тази чувствителност е, че там няма нуклеозоми. Свръхчувствителните места са цис-регулаторни участъци, върху които има нехистонови белтъци-регулатори. Свръхчувствителността в индивидуалното развитие се появява малко преди генът да започне да се презаписва и се запазва дори ако върху него се синтезират само по 3-4 молекули РНК на клетъчно поколение. Свърхчувствителността изчезва само когато генът трайно престане да се експресира. Следователно хистоните могат да се смятат не само за структурни белтъци, а и за неспецифични инхибитори на генната активност.
Регулаторните механизми, отговорни за избирателната кондензация и декондензация на хроматина, все още са недостатъчно изучени, но поне при гръбначните животни включват и химично модифициране на самата ДНК. Цитозиновата база в дублета ЦГ често е метилирана при 5. въглероден атом до 5-метилцитозин. Реакцията се осъществява от ензими – метилази (метилтрансферази). Хетерохроматинът е по-силно метилиран от еухроматина. В рамките на еухроматина активните гени са по-слабо метилирани от останалите, а най-слабо метилирани са промоторите им. Явно метилирането е начин даден ДНК-участък да се бележи като неподлежащ на транскрипция.
Типът на метилирането лесно се предава на дъщерните клетки, защото срещу ЦГ в комплементарната верига има също ЦГ. Т. нар. поддържаща метилаза след репликацията добавя метилова група в новата верига срещу всеки наличен метилов остатък в старата (съответна схема може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=methylation&rid=cell.figgrp.2114. Това важи за повечето клетки и по-голямата част от живота на индивида. През гаметогенезата и зародишното развитие обаче протичат вълни както на деметилиране, така и на метилиране на нови места от т. нар. учредяваща метилаза. Според сегашните данни метилирането не определя пътя на развитие на клетката, а по-скоро го поддържа. Ако метилирането се потисне изкуствено, редица клетки объркват диференцирането си, а някои гени в неактивната Х-хромозома заработват.
При бозайниците майчиният и бащиният хаплоиден набор са неравностойни: при някои гени се експресира само алелът, получен от бащата, при други – от майката. Явлението се нарича геномен импринтинг (imprinting, англ. – отпечатване) и се основава на унаследяване на типа метилиране от родителя.
По-долу регулацията на транскрипцията ще се разглежда с допускането, че хроматинът вече е структурно подготвен.
3.2. Белтъци и ДНК-последователности, регулиращи презаписването
Контролът на инициацията на транскрипцията при еукариотите няма изключителното значение, което има при прокариотите. В еукариотната клетка генната експресия се регулира на няколко етапа. И все пак този начален етап остава най-важният и заслужава специално внимание.
Свързването на РНК-полимеразите с промоторите им става по механизъм, различен от този при бактериите. Ензимите не разпознават самите промотори. Първо с промотора специфично се свързва белтък, наречен транскрипционен фактор. След това РНК-полимеразата се присъединява към комплекса транскрипционен фактор – промотор. По функция еукариотните транскрипционни фактори напомнят прокариотните сигма-фактори. Има обаче съществена разлика: докато сигма-факторите разпознават промотора само ако са свързани с минималния ензим, еукариотните транскрипционни фактори разпознават промотора сами и едва тогава се свързват с РНК-полимеразата. Затова сигма-факторът се смята за субединица на РНК-полимеразата, а транскрипционните фактори по-скоро приличат на "обикновените" активатори. Всъщност понякога терминът транскрипционен фактор се използва в по-широк смисъл изобщо за белтък, който влияе върху честотата на транскрипцията. За да няма объркване, гореописаните белтъци, които участват в инициацията на презаписването на големи групи гени, се наричат общи транскрипционни фактори. В този текст терминът “транскрипционен фактор” ще се използва само за тях, а останалите регулаторни белтъци ще наричаме “транскрипционни регулатори”.
Има няколко транскрипционни фактори, всеки от които разпознава определен набор от промотори и "мобилизира" една от РНК-полимеразите. Транскрипционните фактори се означават с TF (съкр. от англ. transcription factor), номера на РНК-полимеразата и главна латинска буква за конкретния фактор, например TFIIIA.
При промоторите на РНК-полимераза II началната точка най-често е аденозин между два пиримидинови нуклеотида (Т или Ц). Това обаче съвсем не е задължително.
Цялата област от –1 до –30 посочва на ензима къде е началната точка. Почти всички промотори на РНК-полимераза II съдържат консервативен хептамер при –25, наречен ТАТА-блок или блок на Хогнес, със следната консенсусна последователност:
Т А Т А А А А/Т
Очевидна е приликата с прокариотния блок на Прибноу (ТАТААТ). При инициацията ТАТА-блокът се разпознава от един транскрипционен фактор за РНК-полимераза ІІ – TFIID, наречен още ТАТА-фактор. Явно блокът на Прибноу и блокът на Хогнес са хомоложни последователности, а сигма-субединицата и TFIID-факторът са ако не хомоложни, то поне функционално аналогични белтъци. Другата важна последователност на прокариотния промотор, областта на разпознаване (–35), като че ли няма “наследник” в еукариотните промотори.
Изследвани са и някои промотори на РНК-полимераза III. За всеобщо учудване те се оказват вътре в транскрибирания участък, например от +10 до +70. На нас ни се струва по-удобно промоторът да е точно пред +1, както е при бактериите и при РНК-полимераза II; но в крайна сметка не ние презаписваме гените за малките РНК.
Промоторът за РНК-полимераза I е на "логичното" място – пред гена.
Пред самия промотор лежи участък от ДНК, важен за контрола на презаписването – т. нар. преден елемент на промотора. На такива елементи отговарят повечето свръхчувствителни към нуклеази места, ако се съди по разположението им. Схема на свърхчувствителните места при хистоновите гени е дадена на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=hypersensitive&rid=cell.figgrp.1625.
В предния елемент на промоторите за РНК-полимераза II областта малко преди –60 отговаря за честотата на транскрипцията. Обикновено в тази област при –75 присъства консервативен нонамер, наречен ЦААТ-блок, със следната консенсусна последователност:
Г Г Ц/Т Ц А А Т Ц Т
Други цис-регулаторни последователности са енхансерите (enhance, англ. – усилвам). Така се наричат последователностите, които активират даден промотор от разстояние над 100 нуклеотидни двойки в коя да е посока и запазват активността си, ако се обърнат на 180 градуса. Повечето енхансери са на няколко хиляди нд от промотора си. Те обаче се оказват точно до него, когато ДНК се огъне подходящо. Бактериите също имат такава регулация, но за малък брой гени и обикновено тези прокариотни последователности се описват, без да се наричат енхансери. При еукариотите, обратно, почти всички изучени гени имат по 1 – 2 енхансера.
Цис-регулаторните последователности могат да бъдат причина за ефект на положението. Ако даден ген се премести без някои от тях, той може да се транскрибира по нов начин или изобщо да не се транскрибира, независимо че пак е в еухроматинова област. Освен това генът може да се повлияе от чужди регулаторни последователности, които е намерил на новото си място. Цис-регулаторните последователности са къси, но често се "разхвърляни" по дълги участъци и действат от голямо разстояние. Затова типът на експресията се запазва само ако генът се пренесе с много ДНК от двете страни (понякога са нужни над 10 000 нд). Сега става ясно защо еукариотните гени са разпръснати в хромозомите на голямо разстояние един от друг.
Действието и на енхансерите, и на предните елементи на промотора се опосредства от белтъци-регулатори. Те се свързват специфично с прицелната последователност и влияят върху работата на транскрипционните фактори или на самата РНК-полимераза.
Еукариотните регулаторни белтъци подобно на прокариотните имат специални ДНК-свързващи домени. Някои от тях използват "добрия стар" мотив спирала-завой-спирала. Други имат мотиви, неприсъщи на прокариотите. Най-известният от тях се нарича цинкови пръсти. Всеки пръст е част от полипептидната верига, прихваната в двата си края от цинков атом за поддържане на формата. Част от примката образува бета-лист, а друга част – къса алфа-спирала. Пръстът стърчи и може да се пъхне в голямата бразда на двойната спирала. Няколко пръста, подредени един до друг, осигуряват специфично разпознаване. Цинкови пръсти имат например рецепторите за стероидните хормони (половите хормони и хормоните на надбъбречната кора). Тези рецептори са ДНК-разпознаващи белтъци, за които съответните хормони са алостерични активатори.
Цинкови пръсти: А – схема за ролята на цинковия атом (червени кръгчета), пространствената структура не е означена; Б – схема на взаимодействието на два цинкови пръста с ДНК; В – пространствен модел на цинков пръст; Г – пространствен модел на цинков пръст, свързан с ДНК. В и Г са опростени по Klug & Schwabe (1995).
Един регулаторен белтък влияе върху експресията на редица гени и те могат да се презаписват толкова съгласувано, колкото и в бактериалния оперон. И обратно, една транскрипционна единица се регулира от няколко белтъка. Някои от тях имат домени за взаимодействие помежду си освен тези за ДНК. Не за всички има отделни прицелни участъци – някои разпознават една и съща ДНК-последователност и се конкурират за нея. Освен това отделните регулаторни белтъци донякъде се повтарят при различните гени, така че регулацията на целия генотип не изисква безкраен техен набор.
Регулаторните белтъци не са равностойни. Налице е йерархия, при която продуктът на даден регулаторен ген активира не структурни гени, а други "по-нискостоящи" регулаторни гени. Такива каскади се проявяват най-ярко в индивидуалното развитие на многоклетъчните животни. На върха на йерархията стоят малък брой гени, отговорни за определянето на полярността на тялото, а по-късно за оформянето на цял телесен сегмент (гени-селектори) или орган (главни контролни гени).
При някои мутанти вместо една част от тялото се развива друга – явление, наречено хомеотично преобразуване (от хомойос, гр. – подобен). При Drosophila хомеотични мутации са забелязани още от ранните менделисти. Мутантите, които изобщо достигат зрялост, имат тежки морфологични нарушения – например 2 чифта криле, 4 чифта крака или допълнителни крака вместо антени. Благодарение на хомеотичните мутации вече са "уловени" редица регулаторни гени от върха на йерархията. Установено е, че те имат обща консервативна последователност, дълга 180 нд. Тя се нарича хомеоблок, а съответната част от белтъка – хомеодомен. Хомеодоменът съдържа мотива спирала-завой-спирала. Гени с хомеоблок са открити у всички изследвани многоклетъчни животни от мешести до бозайници. По-изненадващо, те присъстват и у растенията и там също направляват развитието.
При дрозофилата отдавна е описан ген, чиито мутации водят до недоразвити очи или пълна липса на очи. Затова той е наречен eyeless (англ. който няма очи). Много по-късно се установява, че продуктът на eyeless носи белезите на транскрипционен регулатор и има хомеодомен. Самият ген показва над 90% хомология с човешкия ген Aniridia и мишия Small eye, чиито мутации причиняват дефекти във всички части на окото – ирис, леща, роговица и ретина. Поначало хомеоблоковите гени са еволюционно консервативни, защото промяна в някой от тях би засегнала всички следващи стъпала в йерархията. Странното е, че приликата в гена се съчетава с принципна разлика в самия орган. Фасетните очи на насекомите са устроени и функционират съвсем различно от очите на бозайниците.
Изказва се хипотезата, че eyeless е главен контролен ген за "поява на око тук и сега", а самото око всяко животно образува както може. Хипотезата е проверена, като в Drosophila е предизвикана експресия на eyeless в части на зародиши, където нормално тя липсва. Резултатът са мушици с допълнителни очи на необичайни места – вместо или върху антените, по или под крилата, по краката – до 14 очи върху една мушица. Допълнителните очи са морфологично нормални, като се изключат по-малките размери и някои слети фасетки тук-там. Освен това фоторецепторните им клетки реагират на светлина, т.е. очите виждат нещо. Снимки на индуцирани по този начин очи могат да се видят на http://neuro.biologie.uni-freiburg.de/Skriptum/eyeless.html.
В някои мушици вместо eyeless е въведен и експресиран мишият ген Small eye. Той предизвиква развитие на допълнителни очи точно като собствения ген на плодовата мушица eyeless.
По приблизителни изчисления eyeless задейства
експресията на около 15% от гените на Drosophila, т.е. поне 2500 гена.
На върха на йерархията са други регулаторни гени, някои от които също съдържат
хомеоблок. Следват гени, които влияят върху клетъчните взаимодействия и
пренасянето на сигнали. В дъното на каскадата са типични структурни гени,
например за родопсин и кристалин. Забележителен е фактът, че експресията
на един-единствен ген води до образуване на сложен орган като фасетното
око, като при това "побеждава" нормалните програми за диференциране.
Основни източници
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular
Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London,
1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
Gilbert S.F. Developmental Biology. 6th Edition. Sinauer Associates,
Inc., Sunderland, USA, 2000. [Online] http://www.devbio.com/
Lewin B. Genes. John Wiley &
Sons Inc., New York, 1983.
Halder G., P. Callaerts, W. Gehring (1995). Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Sciеnce 267: 1788-1792.
URL http://www.mayamarkov.com/biology/06Transcri2/06Transcri2.htm
Публикувано 2003
Copyright © Майя Маркова