ТРАНСКРИПЦИЯ (ПРЕЗАПИСВАНЕ). ТРАНСКРИПЦИЯ И РЕГУЛАЦИЯ НА ТРАНСКРИПЦИЯТА ПРИ ПРОКАРИОТИТЕ
1. Общи особености на транскрипцията
Както е известно, наследствената програма на организма се съхранява кодирана в ДНК. Молекулите ДНК са приспособени да съхраняват информацията надеждно, но по същата причина са толкова инертни, че не са годни за нищо друго. Записана в тях, информацията не може да се използва пряко. Оползотворяването й става възможно благодарение на процес, наречен генна експресия. Той винаги започва с прехвърляне на заложената в ДНК информация върху РНК.
Синтезата на РНК се нарича транскрипция (презаписване), защото се извършва върху матрица (ДНК) и продуктът много прилича на матрицата – като препис на оригинал. Доколкото са копие само на част от ДНК, молекулите РНК са много по-малки, по-подвижни и могат да преминат през цялата клетка. След като си свършат работата, могат да бъдат премахнати, без да се засяга генотипът. Освен това РНК имат по-разнообразна и променлива конформация, тъй като са едноверижни. Някои от тях като белтъците използват тази конформация като основа за различни функции: структурна (рРНК), адапторна (тРНК) или каталитична (рРНК и по-малко известните малки ядрени и цитоплазмени РНК). На повечето гени обаче съответства матрична РНК, която няма свое "интересно поведение", а посредничи между ДНК и рибозомите. мРНК е абсолютно необходима за белтъчната синтеза: при нито един организъм не са открити рибозоми, способни да работят направо с ДНК. Освен това ДНК и рибозомите са донякъде раздалечени при прокариотите и строго разграничени при еукариотите. Следователно мРНК поема и функцията да носи информацията от едното до другото място.
Понеже транскрипцията включва преобразуване на ковалентни връзки, необходимо е участието на ензим. Той се нарича РНК-полимераза, а ако трябва да бъдем съвсем точни – ДНК-зависима РНК-полимераза. Логично е да се попита дали има РНК-полимерази, зависими от нещо друго, а не от ДНК. Повечето РНК-вируси имат ензим, който върху матрица РНК синтезира комплементарна РНК. Името му е РНК-зависима РНК-полимераза или РНК-репликаза. По-нататък обаче няма да става дума за него. Ще обсъждаме само нормалния живот на клетката, когато синтезата на РНК винаги е транскрипция на ДНК.
Свързвайки се с ДНК, ензимът кара двете й вериги да се разделят. Базите на ДНК стават достъпни за рибонуклеотидите, които плуват наоколо разтворени в нуклеоплазмата. По-точно за взаимодействие с тях се открива едната ДНК-верига, наречена матрична. Само към нея се присъединяват рибонуклеотиди. Когато са комплементарни, те остават на място, закрепени върху ДНК с водородни връзки. РНК-полимеразата ги свързва ковалентно във верига РНК. След това ензимът се премества и така РНК (транскриптът) се удължава. Обща схема на транскрипцията може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.975.
Важно е да се разбере, че водородните връзки се образуват спонтанно, без помощта на РНК-полимеразата. Участието на ензим е необходимо само за (био)химичните реакции, т.е. за разкъсването и образуването на ковалентни връзки.
Въглеродните атоми на рибозата и дезоксирибозата се номерират от 1' до 5'. (Без апостроф се номерират въглеродните атоми на азотната база.) Във веригата на нуклеиновите киселини всеки фосфатен остатък е между положения 3' и 5' – т. нар. 3'-5' фосфодиестерна връзка. Двата края на веригата са съответно 3' и 5' според това коя група стърчи свободно навън. В двойната спирала на ДНК веригите са антипаралелни: срещу 3' края на едната застава 5'-краят на другата.
Матричната верига ДНК и изграждащата се РНК също са антипаралелни. РНК-Полимеразата може да добавя нуклеотиди само в посока 5' – 3'. Следователно матричната верига се разчита в посока 3' – 5'. Матричната верига (оттам и посоката) се определят за всеки ген поотделно. Всяка от двете ДНК-вериги е матрична при някои от гените и допълнителна при останалите.
Долната схема показва началото на транскрипцията, т.е. свързването на първите нуклеотиди. Фосфатните остатъци са означени с (Р). На тази схема е показан важен елемент, който беше пропуснат на предишните фигури – свободните рибонуклеотиди, т.е. субстратът на реакцията. Вижда се, че те предварително са фосфорилирани до 5'-нуклеозидтрифосфати (АТФ, УТФ, ГТФ и ЦТФ). От трите фосфатни групи в РНК остава само едната. Другите две обаче също не са излишни.
Ако поначало беше предвидена само една фосфатна група, т.е. ако субстрат бяха нуклеозидмонофосфати, РНК нямаше да се получи. Поликондензацията с отделяне на вода може да протече на сухо в нагрят тиган, но във воден разтвор е термодинамично неизгодна. Изгодна е обратната реакция – хидролизата на РНК.
Положението се променя, ако се използват нуклеозиддифосфати. Поликондензацията би се улеснила от това, че се разкъсва неустойчива (макроергична) връзка. Освен това страничният продукт е фосфорна киселина, а не изобилната вода. И все пак реакцията не е това, което трябва на клетката. Макар че РНК in vitro може да се синтезира от нуклеозиддифосфати, in vivo обратната реакция отново надделява.
Когато субстрат са нуклеозидтрифосфати, вторият продукт вече не е фосфат, а пирофосфат. Изобщо биохимичните превръщания, които са най-малко склонни да протичат самоволно, са уредени чрез спрягане с хидролизата на АТФ до АМФ + ФФ. После пирофосфатът ФФ се хидролизира до два фосфатни йона от вездесъщия в клетката ензим неорганична пирофосфатаза. Знае се, че отстраняването на някой от продуктите е отличен начин да се насочи химичната реакция накъдето трябва. Енергетичната цена е висока, но клетката не пести при процеси, от които зависи животът й.
Транскрипцията включва три етапа. През първия, наречен инициация (започване), РНК-полимеразата се ориентира в положението. Презаписването не може да започва от какви да е места. Трябва да се разбере къде има ген, къде е началото му и накъде продължава, т.е. коя е матричната верига. Ензимът получава тази информация от първичната структура (нуклеотидната последователност) на ДНК. Участъкът от ДНК, разпознаван като сигнал за транскрипция, се нарича промотор. След като се свърже с него, ензимът предизвиква разтваряне на веригите и поставя началото на бъдещата РНК, като образува фосфодиестерна връзка между първите 2 нуклеотида. Първият презаписван нуклеотид се означава като начална точка.
Вторият етап се нарича елонгация (удължаване). Състои се в монотонно присъединяване на нуклеотиди към РНК-веригата. Принципът на реакцията беше вече описан. Освен РНК-полимеразата в този период работят и топоизомерази. Без тях всеки по-дълъг транскрипт би се оказал безнадеждно омотан около ДНК.
Доколкото е нужна определена РНК, а не огромен препис от половината геном, върху ДНК към всеки промотор се предвижда и място за приключване. Когато РНК-полимеразата го достигне, тя го разпознава и презаписването навлиза в последния си етап – терминация (завършване). ДНК-участъкът, където транскрипцията се прекратява, се нарича терминатор, а последният презаписван нуклеотид – крайна точка. Ензимът спира да пълзи по ДНК и се отделя от нея. РНК също се освобождава и започва самостоятелно съществуване.
Целият участък от ДНК, който се презаписва под контрола на един промотор, се нарича транскрипционна единица. Макар че идеята на презаписването е да се експресират гените, понятията транскрипционна единица и ген не са съвсем равнозначни.
2. Транскрипция при прокариотите
Прокариотната РНК-полимераза се състои от 5 субединици: две еднакви алфа и по една бета, бета-прим и сигма. (За да могат да се разчитат от всички компютри, гръцките букви в този сайт ще бъдат изписвани с кирилица.) Този комплекс се нарича пълен ензим или холоензим. Тъй като е положително зареден, той е склонен да се свързва с произволни области от ДНК. Свързването обаче е лесно обратимо. Ако мястото не изглежда подходящо за започване на транскрипцията, ензимът се откача и прави втори опит. Едва когато улучи промотор, се свързва здраво и пристъпва към презаписване.
Когато се означават ДНК-последователности, използва се следната "координатна система": Обикновено се означава само едната верига – тази, която прилича на получената РНК. Това значи не матричната, а комплементарната й верига. Посоката 5' – 3' се приема за положителна и нуклеотидите се записват в този ред. Съответно посоката 3' – 5' е отрицателна. Началната точка се означава с +1. Следващият нуклеотид е +2, а предишният (т.е. съседният в (–)-посока) е –1. Няма нулев нуклеотид!
5' ... –3 –2 –1 +1 +2 +3 +4 ... 3'
Разбира се, началната точка и положителната посока са валидни само за разглеждания ген.
Прокариотните промотори се простират от +1 до около –40. След като се свърже с промотора, РНК-полимеразата се настанява така, че да обхване началната точка. След това ензимът предизвиква разделяне на двете ДНК-вериги. Макар че денатурацията обхваща къс участък (около 17 нуклеотидни двойки), тя е енергетично неизгодна. За да може да се осъществи, се използва и потенциалната енергия на (–)-свръхспирализираната ДНК.
Към оголената матрична верига започват да се присъединяват допълнителни рибонуклеотиди. Холоензимът образува първата фосфодиестерна връзка. След това сигма-субединицата се отделя от останалата част на ензима и напуска сцената на презаписването. Инициацията завършва.
Субединицата сигма, наречена още сигма-фактор, е нужна само за започването. Елонгацията се осъществява от комплекса от останалите 4 субединици. Той се нарича минимален или сърцевинен ензим (кор-ензим). След като първите 2 рибонуклеотида се свържат, транскрипцията става необратима. Сърцевинният ензим не може нито да се върне назад, нито да се откачи преди отреденото за целта място. Той напредва в (+)-посока (5' – 3') и заедно с него се движи отвореният участък от 17 нуклеотида. 12 от тях са свързани с изграждащата се РНК в хибридна двойна верига. Зад РНК-полимеразата двойноспиралната структура на ДНК се възстановява, измествайки РНК-продукта навън.
Така РНК-полимеразата стига до терминатора. Докато промоторът лежи пред транскрибирания участък, терминаторът е в неговите граници и обхваща последните презаписвани нуклеотиди. Всички прокариотни терминатори включват палиндром малко преди крайната точка. Палиндром е дума или стих, еднакъв при четене отляво и отдясно, например ”невен”. В ДНК палиндроми се наричат последователностите с централна симетрия, които имат един и същ вид в двете посоки и двете комплементарни вериги, например ЦААТТГ. Вижда се, че във всяка верига лявата половина на палиндрома е комплементарна на дясната. Терминаторът има палиндром, доста по-дълъг от посочения. След като той се транскрибира, получената РНК подгъва края си и се сдвоява сама със себе си, образувайки бримка с вид на фиба. РНК-полимеразата разпознава тази вторична стрктура и спира.
При някои терминатори палиндромът е богат на Г и Ц. Тези бази се свързват с по 3 водородни връзки (срещу 2 за А и Т). Бримката се поддържа от много връзки и е здрава. Освен това последните няколко нуклеотида са Т, съответно РНК зъвършва с олигоУ. Връзките между уридина и дезоксиаденозина са толкова слаби, че комплексът ДНК – РНК – РНК-полимераза се разпада спонтанно. Тези терминатори се наричат ро-независими.
Останалите терминатори са ро-зависими, защото изискват помощта на т. нар. фактор ро. Това е белтък, който се свързва с изграждащата се РНК откъм 5'-края и пълзи по нея в посока 5' – 3'. Функцията на ро-зависимия терминатор е да задържи на място РНК-полимеразата достатъчно дълго, за да може факторът ро да я догони. Свързвайки се с РНК-полимеразата, ро я кара да се отдели от матрицата и да освободи РНК.
Бактериалната транскрипция е подходящ прицел за антимикробната химиотерапия. Някои антибиотици потискат синтезата на РНК в прокариотни клетки, като се свързват с бактериалната РНК-полимераза. Такива са например рифамицините, чийто най-известен представител е рифампицинът.
3. Регулация на транскрипцията при прокариотите
Всяка клетка е способна на твърде много дейности, за да ги поддържа постоянно. Някои от тях ще се окажат неуместни за момента, а други, осъществени едновременно, не биха довели до нищо добро. За да живее клетката, трябва всеки неин ген да се експресира тогава и само тогава, когато продуктът му е нужен. Следователно може да се очаква прецизен контрол върху генната експресия. При прокариотите той влиза в пълна сила още при транскрипцията. Самата транскрипция се регулира почти изцяло на етап инициация. Така че при прокариотите наследствената информация се реализира според пословицата "Където има начало, има и край".
С известно опростяване може да се каже, че транскрипцията се регулира чрез специфично взаимодействие на белтъци с ДНК-последователности. Специфичността на свързването отличава регулаторните белтъци от такива като хистоните, които са способни да се закрепят където и да е по ДНК. За неспецифично свързване с ДНК трябва само положителен заряд и някакво най-грубо съответствие във формата. Специфичното разпознаване поставя пред белтъка много по-високи изисквания. Той трябва да има пространствено сродство към "своя" участък от ДНК, както ензимът е нагоден към субстрата, антитялото – към антигена или рецепторът – към хормона. Първичната структура на ДНК се отразява върху формата на спиралата – наклон на базите, ъгъл между две съседни бази. Редица ДНК-свързващи белтъци използват геометричното "изкривяване", за да разпознаят своя ДНК-участък. Така няма нужда последователността на базите да се разчита пряко. Има обаче и белтъци, способни да "видят" нуклеотидната последователност. Двойната спирала има 2 бразди – голяма и малка. Те са показани например на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1997.
Откъм голямата бразда базите са достатъчно открити, за да бъдат разпознати дори и без разтваряне на двете вериги. Много регулаторни белтъци имат по молекулите си издадени части, които се пъхат в голямата бразда. Малката бразда се разучава по-трудно, но някои белтъци използват и нея.
Първото взаимодействие белтък – ДНК, свързано с регулацията на транскрипцията, е разпознаването на промотора от РНК-полимеразата. ДНК-последователността на промотора го "легитимира" пред РНК-полимеразата, а после й посочва откъде да започне презаписването и върху коя верига. Може да се очаква последователностите, натоварени с тези функции, да бъдат еднакви или почти еднакви при всички промотори. Изследването на различни промотори е разкрило 3 консервативни места. Те са следните:
Началната точка (положение +1) обикновено е пуринов нуклеотид – или А, или Г.
Почти всички промотори малко преди началната точка съдържат хексамер, подобен на ТАТААТ. Всъщност доста рядко ще видим точно това. Обикновено в конкретния промотор един или повече нуклеотида са различни. Ако обаче за всяко от шестте положения се посочи най-често срещания нуклеотид в голям брой промотори, ще се получи ТАТААТ. Това е т. нар. средностатистически (консенсусен, каноничен) вид на последователността. Подобният на ТАТААТ хексамер се нарича блок на Прибноу, а също така последователност –10, защото центърът му най-често е там. Първичната му структура подпомага разделянето на двете ДНК-вериги. Това важи за всички последователности, богати на А и Т, защото две водородни връзки се късат по-лесно, отколкото три.
По-нататък в посока (–) повечето промотори имат друг консервативен хексамер с каноничен вид ТТГАЦА. Той се нарича област на разпознаване или последователност –35. За областта между –10 и –35 от значение е не последователността, а само дължината.
–10 и –35 при инициацията едновременно реагират със сигма-субединицата на холоензима, както е показано на долната схема. Самата форма на сигма-фактора е причина разстоянието между двата разпознавани участъка да бъде важно, а намиращите се там нуклеотиди да не са от особено значение.
Свързване на сигма-субединицата с –10 и –35. С малки изменения по Hochschild & Dove (1998).
Дори и изненадващо късите консервативни участъци –10 и –35 не се споделят от всички промотори. В останалите си участъци промоторите съвсем не си приличат. Разнообразието им отразява регулацията на транскрипцията. Вероятно за същата функция е необходима и сложността на бактериалната РНК-полимераза. При някои фаги РНК-полимеразите са много по-малки и по-прости. Например Т3 и Т7 имат мономери. Фагите обаче използват малко гени, чиято регулация е сравнително лека задача. Прокариотната клетка има поне няколкостотин транскрипционни единици. Някои от тях трябва да се презаписват непрекъснато, други – рядко, а трети – с различна честота в зависимост от условията. РНК-полимеразата се отнася различно към различните промотори според първичната им структура. С някои се свързва здраво и започва презаписване всеки път, когато попадне на тях. С други промотори ензимът не се свързва толкова здраво и може да се откачи, преди да е започнал работа. Съответно те се използват по-рядко. Това не е недостатък, а показва, че клетката се нуждае от дадения белтък или РНК в малко количество. Трети промотори изобщо не могат да работят сами. За да задържат РНК-полимеразата, те се нуждаят от помощта на регулаторни белтъци. Такива са повечето от промоторите-изключения, които нямат последователността –35.
Изобщо е досадно, че щом се открие някаква закономерност за функционирането на клетката, почти веднага се установяват ред изключения. В случая трябва да се обясни как работят "странните" промотори без –35 или –10. Някои от тях, както се спомена, задържат холоензима с помощта на регулаторни белтъци. Други се разпознават от друг холоензим. Досега за сигма-субединицата се говореше така, като че ли тя е единствена. Наистина обикновено работи една сигма-субединица, разпознаваща описания по-горе тип промотори. Понякога обаче тя се подменя с друг сигма-фактор, прикрепен към същия минимален ензим, но със сродство към друг набор от промотори. Такава регулация, засягаща наведнъж много транскрипционни единици, се наблюдава при спорообразуването на бацилите. Включват се гени, които в обичайния живот на клетката "мълчат". Такъв контрол на презаписването обаче се среща сравнително рядко. Бактериите сменят обикновената си сигма-субединица неохотно.
Обратно, регулацията с допълнителни белтъци е повсеместна. Дори и когато промоторът може да се справи сам, обикновено за него са предвидени регулаторни белтъци, които влияят върху честотата на транскрипцията. Ако белтъкът намалява или спира презаписването, което без него върви добре, регулацията се нарича отрицателна, а белтъкът – репресор. Ако белтъкът усилва транскрипцията или изобщо я прави възможна, той е активатор и осъществява положителна регулация.
Специфичното свързване белтък – ДНК изисква съответен мотив в структурата на белтъка. Въпреки че броят на регулаторните белтъци е огромен, техните ДНК-разпознаващи мотиви могат да се сведат до няколко основни типа. При прокариотите най-разпространен е т. нар. спирала-завой-спирала. Името показва, че мотивът е съчетание от две алфа-спирали, свързани с огънат къс пептид. Едната спирала, наречена разпознаваща, се разполага в голямата бразда и образува водородни връзки с базите (това може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.2009).
Описаната структура е повторена – белтъците със спирала-завой-спирала са симетрични хомодимери, т.е. спиралите са поне 4. Затова разпознаваните последователности, макар и различни за отделните белтъци с този мотив, винаги са симетрични (палиндроми). Палиндромът има за тези регулаторни белтъци същото значение на прицелна последователност, каквото имат блокът на Прибноу и областта на разпознаване за РНК-полимеразата. Двете еднакви разпознаващи спирали са пространствено сближени – разделя ги само 1 оборот на ДНК-спиралата. Опростени модели на ДНК-свързващите домени на няколко белтъка със спирала-завой-спирала са показани на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.2010.
Повечето регулаторни белтъци освен ДНК-свързващ домен, който съдържа характерния мотив, имат и други части. Например могат да съдържат домен за свързване с РНК-полимеразата или/и с алостеричен "регулатор на регулатора". При много белтъци със спирала-завой-спирала алостеричен ефектор променя разстоянието между двете разпознаващи спирали. Оттам се променя сродството на белтъка към прицелната ДНК-последователност. Ще разгледаме примери, в които транскрипцията се управлява чрез алостерична регулация на ДНК-свързващи белтъци. Става дума за два добре изучени оперона на E. coli.
Генът е участък от молекулата на ДНК, който кодира полипептид, тРНК или рРНК. Това определение поне при прокариотите не създава особени проблеми. Оперонът е група функционално свързани гени, които се презаписват заедно. Повечето прокариотни гени са включени в оперони, така че типичната транскрипционна единица тук съдържа два или повече гена. Първият изследван оперон е лактозният. Той кодира 3 белтъка, нужни за разграждането на лактозата. Гените им се означават като структурни гени. Подредени са по следния начин:
Бета-галактозидазата хидролизира лактозата до глюкоза и галактоза. Бета-галактозидпермеазата осигурява влизането на лактозата в клетката. Третият ензим не е толкова важен. Той служи за обезвреждане на евентуални отровни аналози на лактозата. Терминаторът, който е зад неговия ген, не е показан.
Подобно на нас E. coli предпочита глюкозата и смята останалите въглехидрати за "храна второ качество". (Тази пристрастност вероятно е възникнала случайно в ранната биохимична еволюция.) Докато има глюкоза в изобилие, опероните за катаболизъм на други съединения, включително лактозният оперон, се презаписват слабо. За усилената им транскрипция е нужен активаторът CAP (съкр. от catabolite activator protein), а той при тези условия е неактивен. Когато глюкозата намалее, ензим превръща АТФ в цикличен АМФ. Последният се свързва с САР и го активира алостерично. Активният САР от своя страна активира редица катаболитни оперони, като се прикрепя близо до промоторите им и помага на РНК-полимеразата да се свърже. При лактозния оперон участъкът за свързване на САР е малко преди промотора (не е означен на схемата).
Интересно е, че макар при еукариотите генната експресия да се регулира другояче, в някои човешки клетки цАМФ е запазил древното си значение на сигнал, че глюкозата се изчерпва.
Ако около клетката освен глюкоза липсва и лактоза, оперонът не се транскрибира; безсмислено е да се трупат ензими, ако субстрата го няма. Транскрипцията се предотвратява от репресор. Той се свързва специфично с ДНК-участък, наречен оператор. На схемата операторът е даден след промотора, а всъщност двата участъка отчасти се припокриват. Настанявайки се върху оператора, репресорът пречи на РНК-полимеразата да се добере до промотора.
И операторът, и репресорът се симетрични. Репресорът се кодира от гена lacI, разположен извън лактозния оперон. За да се отличи от структурните гени, този ген се означава като регулаторен ген.
Ако в следата се появи лактоза, съвсем малко от нея успява да влезе в клетката – било чрез някакво остатъчно количество галактозидпермеаза, било чрез преносители за други вещества. В цитозола лактозата се подлага на биохимично преобразуване. Получава се производно, наречено алолактоза. То се свързва алостерично с репресора. Конформацията на репресора се променя, той губи сродството си към оператора и се отделя от ДНК. РНК-полимеразата безпрепятствено се свързва с промотора и транскрипцията започва.
Алолактозата се нарича индуктор, защото благодарение на нея оперонът започва да се транскрибира. Такава регулация е типична за катаболитните оперони: субстратът (или негово производно), свързвайки се с репресора, го инактивира. Схема на регулацията на лактозния оперон може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=lac&rid=cell.figgrp.2042.
Триптофановият оперон на E. coli има 5 структурни гена. Те кодират ензими, нужни за синтезата на триптофана. Подредени са по следния начин:
5’ – Р – О – trpE – trpD – trpC – trpB – trpA – t – 3’
(Р – промотор, О – оператор, t – терминатор.)
Ако триптофанът в клетката не достига, оперонът се транскрибира свободно. Репресор има, но той е неактивен. Когато съдържанието на триптофан се повиши, молекула от него се свързва с репресора и го активира. Оперонът "се изключва". Схема на регулацията на триптофановия оперон може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=tryptophane&rid=cell.figgrp.2036.
Изобщо анаболитните оперони по правило се регулират чрез отрицателна обратна връзка: крайният продукт на биохимичния път служи като корепресор – алостерично активира репресора. Долната схема сравнява действието на алостерично регулираните репресори при катаболитен и при анаболитен оперон.
Контрол на генната активност чрез алостерично регулирани репресори
Понякога белтъците-регулатори се активират и инактивират не чрез алостерично свързване, а чрез ковалентно модифициране (например фосфорилиране), макар че то е по-типично за еукариотната клетка. Освен това самата синтеза на белтъка-регулатор също подлежи на регулация.
Прокариотните регулаторни белтъци (и репресори, и активатори) упражняват действието си по 4 начина, които са дадени на долната фигура.
Начини на действие на прокариотните транскрипционни регулатори: А – свързване с ДНК-участък, съседен на промотора или припокриващ се с него; Б – свързване с отдалечен от промотора ДНК-участък; В – съвместно действие на два регулаторни белтъка, често свързани с раздалечени ДНК-участъци; Г – алтернативен сигма-фактор. По Alberts et al. (1994) с изменения.
Досега ставаше дума главно за първия начин, който е най-разпространен. При него операторът или се припокрива с промотора (било от 5', било от 3'-страната), или изцяло се помества в промотора. Свързвайки се с оператора, репресорът заема част от промотора и не допуска до него РНК-полимеразата. Активаторите обикновено се свързват точно преди промотора. Оттам им е най-удобно да контактуват с РНК-полимеразата и да я убеждават, че оперонът си струва труда.
Понякога активаторът се прикрепя към ДНК далеч от промотора. Такъв активатор се свързва с РНК-полимеразата с помощта на огъване на ДНК (втората рисунка).
Третият механизъм е съчетание от първите два. Включва едновременното участие на 2 регулаторни белтъка, които взаимодействат помежду си. Такава усложнена регулация е по-типична за еукариотите, но се среща и при прокариотите, например при арабинозния оперон на E. coli. (Тук се полага благодарност, задето оперонът само се споменава.)
Последнияг механизъм, който беше вече споменат, се състои в подмяна на сигма-фактора.
Моментът сега е подходящ да се въведат понятията за цис- и транс-действие. Думите са от латински произход: cis – отсам, trans – оттатък, отвъд. Ако два ДНК-участъка са върху една молекула ДНК, казва се, че те са в цис-положение; ако са включени в различни ДНК-молекули, те са в транс-положение. При изучаването на генома на E. coli често е възниквал въпросът дали дадени две рецесивни мутации със сходно действие засягат един ген или различни близко разположени гени. За да се получи отговор, мутациите са били съчетавани в транс-положение в един индивид (например чрез конюгация между две бактерии, всяка с по една мутация). Понеже присъствието на допълнително копие от даден ген в клетката би могло да има неочаквани последици, трябва да се осигури и контрола, в която двете мутации са събрани в цис-положение чрез рекомбинация. Опитът се нарича цис/транс тест или тест за комплементация.
Схема на цис/транс тест. Показани са безсмислени мутации като най-прости.
Да разгледаме най-честия случай, когато мутациите са рецесивни. Тогава контролните клетки, които ги съдържат в цис-положение, трябва да бъдат фенотипно нормални. Ако клетките, носещи мутациите в транс-положение, също имат нормален фенотип, казва се, че мутациите се комплементират (допълват). Изводът е, че те засягат различни гени. Понякога бактерията остава мутантна, т.е. мутациите не се допълват. Тогава заключението е, че те засягат един и същ ген. Логиката е следната: ако мутациите са в различни гени, след конюгацията частично диплоидната клетка ще има по 1 работещ алел от всеки от двата гена; ако мутациите са в един ген, конюгацията само ще събере на едно място два негодни алела, а клетката ще остане лишена от нормалния продукт на този ген.
Мутации, които не се допълват, се причисляват към една група на комплементация или цистрон. Ясно е, че понятията цистрон и ген са синоними, но по традиция цистрони се наричат само структурните гени.
Когато за една ДНК-последователност се установи, че регулира експресията на някой ген, един от първите въпроси е дали тя е регулатор с цис-действие или с транс-действие. Цис-действащите регулаторни последователности вършат работа само ако са на същата молекула ДНК, на която е и регулираният ген (и то на определено място спрямо него). Транс-действащите регулаторни последователности се проявяват дори ако са на друга молекула ДНК. Очевидно те действат не пряко, а като кодират някакъв продукт, способен да дифундира из цялата клетка. При досега изучените транс-регулатори този продукт е регулаторен белтък; принципно би могъл да бъде и РНК. Транс-регулаторните последователности са регулаторни гени, докато цис-регулаторните последователности в общия случай не кодират собствена РНК и следователно не отговарят на определението за ген.
Измежду споменатите по-горе регулаторни последователности промоторът, операторът и мястото за свързване на САР са с цис-действие, а гените за сигма-факторите, репресорите и САР – с транс-действие.
Основни източници
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular
Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London,
1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
Hochschild A., S.L. Dove (1998). Protein-protein contacts that activate
and repress prokaryotic transcription. Cell 92: 597-600.
Lewin B. Genes. John Wiley &
Sons Inc., New York, 1983.
URL http://www.mayamarkov.com/biology/05Transcri1/05Transcri1.htm
Публикувано 2003
Copyright © Майя Маркова