ОРГАНИЗАЦИЯ НА НАСЛЕДСТВЕНИЯ МАТЕРИАЛ ПРИ ЕУКАРИОТИТЕ
1. Ядрена ДНК
Наследственият материал при еукариотите е почти изцяло съсредоточен в ядрото, което е “диагностичен белег” на еукариотната клетка. На снимката долу се вижда ядро, наблюдавано с електронен микроскоп. Още при ранните микроскопски изследвания е станало ясно, че ядрото е изпълнено с добре багрещо се вещество. Нарекли са го хроматин. Той бива рехав – еухроматин (означен с 1 – светлите участъци във вътрешността на ядрото), и плътен – хетерохроматин (2 – тъмните места). Вижда се, че най-много хетерохроматин има под ядрената обвивка. Около ядърцето също се струпва хетерохроматин и вероятно такъв е тъмният участък в средата на ядрото. Самото ядърце е останало извън плоскостта на среза.
Ядро от миша тимусна епителна клетка под електронен микроскоп. А. Общ изглед. Б. Увеличен участък от дясната страна. Отсечките са по 1 микрометър. 1 – еухроматин, 2 – хетерохроматин, 3 – ядрена пора, 4 – ендоплазмена мрежа. Снимката е любезно предоставена от Цветана Маринова от катедра Биология на Медицинския университет – София.
На увеличената част от снимката (Б) ясно личат двете мембрани на ядрената обвивка и затвореното между тях пространство, наречено перинуклеарно. Външно ядрената обвивка много прилича на цистерните на зърнестата ендоплазмена мрежа (една цистерна е означена с 4). Всъщност външната ядрена мембрана преминава в мембраните на ендоплазмената мрежаи често носи рибозоми.
На места обвивката е прекъсната от тунели – пори (3), под които хроматинът е “разчистен”. Всяка пора се поддържа от белтъчен цилиндър, наречен поров комплекс. Порите са доста широки и нагъсто разположени, така че не можем да очакваме ядрото да се различава от цитозола по състав на нискомолекулните вещества. Ядрената обвивка обаче може да спре или по-точно да постави под контрол движението на макромолекулите. През порите преминават доста големи молекули и надмолекулни комплекси (например новоизградени рибозоми), но само в "разрешената" посока и момент. Освен това обвивката, колкото и пореста да е, защитава ДНК от механичните движения и напрежения в цитоплазмата.
Освен двете липидни мембрани ядрената обвивка поне при многоклетъчните животни включва и белтъчен слой – т. нар. ядрена ламина. Тя постила отвътре вътрешната ядрена мембрана. Представлява плоска мрежа от нишки, които много приличат на интермедиерните филаменти в цитоплазмата. Съставена е от 3 белтъка, наречени ламини. По първична структура те също наподобяват белтъците на цитоплазмените интермедиерни филаменти. Всъщност цитоплазмените интермедиерни филаменти са струпани най-вече около ядрото и вероятно го "подпират" отвън, както ламината му осигурява опора отвътре. Електронно-микроскопска снимка на ядрена ламина може да се види например на http://perth.uwlax.edu/faculty/howard/MCATreview1/sld004.htm
Хроматинът е комплекс на ДНК с белтъци. Те са в приблизително равни тегловни съотношения. Повече от половината белтъчна маса в хроматина се пада на няколко родствени структурни белтъка с основен характер, наречени хистони.
Ако хроматинът се подготви за електронно-микроскопско наблюдение в присъствие на прекалено малко соли, при силно увеличение се вижда нещо като наниз от мъниста. Такава снимка е показана например на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.162.
"Мънистата" се наричат нуклеозоми (в превод "ядрени телца" от лат. nucleus – ядка, гр. сома – тяло). Те имат диаметър около 10 nm и се падат средно на всеки 200 нуклеотидни двойки (нд) отДНК. Всяка нуклеозома се получава, като участък от ДНК се увие около белтъчен октамер (комплекс от 8 белтъчни молекули).
Октамерът се състои от т. нар. сърцевинни хистони Н2А, Н2В, Н3 и Н4, всеки представен с по 2 молекули. Връзките между осемте молекули са слаби. Плътно свързаният с тях ДНК-участък обхваща 145-147 нуклеотидни двойки. Той се усуква около белтъците почти 2 пъти във вид на лява свръхспирала. Това може да се представи по следния начин:
Цилиндърът е само най-грубо приближение за формата на октамера. В действителност той изглежда много по-сложно и има спирален жлеб, улесняващ нагъването на ДНК. Това ясно се вижда на дървен модел от 1985, основан на рентгеноструктурни данни за октамера. По формата на жлеба авторите са заключили как ДНК се увива около сърцевинните хистони и са я добавили, получавайки модел на нуклеозомата като цяло.
Модел на нуклеозома – изглед отстрани. По Burlingame et al. (1985) с изменения.
Подробен модел на нуклеозома, гледана отпред, може да се види например на http://www.rwth-aachen.de/bio1/MolGenetic/OurProjects/Chromatin/Pictures/Figure1.htm. Молекулата на всеки от четирите сърцевинни хистона се състои от 3 домена: централен и два крайни, наречени опашки. Централният домен съдържа три алфа-спирални участъка под ъгъл един спрямо друг. Този триспирален мотив се нарича хистоново нагъване. Опашките нямат определена структура. Някои от тях се протягат навън и могат да се свържат с други нуклеозоми.
Сърцевинните хистони са много консервативни белтъци. Това значи, че хистоните на организми с далечно родство си приличат силно. Бавната еволюция е присъща на гени, свързани с най-основните жизнени процеси, които протичат в непроменен вид при големи групи организми. (Бързо еволюират гени, свързани с начина на живот на конкретния организъм, например гените за повърхностни клетъчни рецептори.)
В нуклеозоми е опакована огромната част от ДНК, но не цялата. Има специални участъци, чиято функция изисква те да са свободни от нуклеозоми. За това ще стане дума по-късно.
Между всеки две съседни нуклеозоми има участък от ДНК, който ги свързва, без да е намотан около никой от двата октамера. Тази ДНК се нарича линкерна (link, англ. – свързвам). Ако на една нуклеозома съответстват средностатистическите 200 нд, а със сърцевинните хистони са ангажирани 145 нд, то линкерното парче ще бъде дълго средно 55 нд. Линкерната ДНК се вижда на снимката на “наниза от мъниста” като тънка нишка между нуклеозомите.
Съществуват ензими, които късат веригата на нуклеиновите киселини във вътрешната й част. Те се наричат ендонуклеази. Някои от тях атакуват най-вече линкерната ДНК – очевидно хистоновият октамер им пречи. Такава е например ендонуклеазата, изолирана от бактериите микрококи.
Правен е опит, при който ДНК се обработва с микрококова ендонуклеаза и се подлага на електрофореза. Вече обсъдихме електрофорезата при белтъците; методът се използва и за разделяне на нуклеинови киселини. ДНК се движи към анода, понеже фосфатните остатъци в скелета й са отрицателно заредени. При това зарядът е пропорционален на молекулната маса, защото фосфатните групи се повтарят периодично по цялата верига. Ето защо електрофорезата на нуклеинови киселини наподобява белтъчната SDS-електрофореза. Веригите се провират през гела толкова по-трудно, колкото са по-дълги, и се разделят по молекулна маса. В гела успоредно на електричното поле се оформят пътеки, постлани с различно дълги фрагменти ДНК, като най-късите парчета са най-отпред.
Долната снимка показва гел с ДНК след ендонуклеазна обработка и електрофореза. Пробата се е движила отгоре надолу. ДНК е оцветена с флуоресцентна боя (етидиев бромид), добавена в гела. Четирите старта отговарят на 4 проби с различно съдържание на микрококова нуклеаза. За левия старт е използван най-малко ензим и там се вижда само високомолекулна ДНК, “разстлана” в началната част на гела. На следващите стартове обаче високомолекулната ДНК намалява, а в крайната част на гела се появяват характерни ивици, подредени като логаритмична скала. Те са отделни (дискретни), понеже ензимът е рязал не произволно, а в определени точки, разположени периодично по двойната спирала. Най-долната ивица отговаря на ДНК от една нуклеозома, втората отдолу нагоре – на 2 нуклеозоми, следващата – на 3 и т.н. Картината се нарича "нуклеозомна стълбица". Ако ендонуклеазната реакция се остави да протече докрай, после на гела ще се вижда само една дебела ивица – най-долната, т.е. най-нискомолекулната.
Гел с нуклеозомна стълбичка. Виждат се четири проби, подредени отляво надясно по възходящ ред на количеството ензим. Снимката е любезно предоставена от Радина Костадинова от Бернския университет.
От номерата на сърцевинните хистони се подразбира, че някъде трябва да има и Н1. Такъв хистон наистина съществува (по-точно група хистони, защото обикновено има няколко разновидности за различните тъкани). Той не изгражда нуклеозомата, а се присъединява към нея отвън, като се свързва с линкерния участък и "закопчава" ДНК в местата на влизане и излизане от нуклеозомата (модел за начина му на свързване може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1629). В еволюцията линкерните хистони Н1 показват доста по-голяма изменчивост от сърцевинните хистони, макар че, сравнени с белтъците изобщо, все пак са консервативни.
Въпреки че е силно основен, Н1 сравнително лесно се откъсва от ДНК в експериментални условия, например когато солевата концентрация падне. Тогава се получава "наниз от мъниста". Ако хроматиновата нишка се подготвя за електронно-микроскопско наблюдение в присъствие на нормално количество соли, Н1 остава на мястото си и картината е друга. Получава се нишка (фибрила) с диаметър 30 nm (вж. отново http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.162). Стърчащите от нуклеозомите хистонови опашки подпомагат нейното образуване, но не могат да го осъществят сами, без Н1.
Строежът на 30-nm фибрила още не е съвсем изяснен. Предполага се, че тя е или плътна спирала (соленоид) с 6 нуклеозоми на оборот, или по-сложна спирала с кръстосване на линкерните участъци. Тези алтернативни модели могат да се видят например на http://www.biophysj.org/cgi/content/full/80/4/1940/F2.
Тъй като покрай нуклеозомата отново става дума за свръхспирализация, редно е тя да се поясни. Поначало еукариотната ядрена ДНК е линейна. Това обаче не й пречи да бъде (–)-свръхспирализирана подобно на прокариотната ДНК. Дори степента на свръхспирализация е същата въпреки разликите в опаковката с белтъци. Свръхспирализацията се осъществява в бримки (домени) със средна дължина около 60 килобази. Краищата на всяка бримка се държат съединени от белтъци, които не са хистони. Скъсването на фосфодиестерна връзка води до релаксиране на домена. Следователно, както и при прокариотите, свръхспирализацията освен увиване на ДНК около белтъци (в случая хистони) включва и активно допълнително усукване. И тук за него отговарят топоизомерази.
Бримките изглеждат закрепени с краищата си за т. нар. ядрен матрикс или нуклеоскелет – съвкупност от нишки, съставени от нехистонови белтъци, които пронизват ядрото. Тази структура най-добре може да се наблюдава, след като по-голямата част от хроматина се отстрани с помощта на дезоксирибонуклеаза (ДНаза) и детергент. Нуклеоскелетът играе за ДНК същата роля, каквато има цитоскелетът за органелите, но засега е много по-слабо изучен. В периферията на ядрото той се свързва с ядрената ламина.
Такава е опаковката на еухроматина през интерфазата. Тя е сравнително рехава и затова еухроматинът изглежда светъл. По време на митозата хромозомите се опаковат допълнително. Модел за следващите степени на опаковка на хроматина е даден на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=chromatin&rid=cell.figgrp.1655. Хетерохроматинът след края на митозата не се разопакова много, така че и през интерфазата е уплътнен приблизително колкото митотичния хроматин. Затова при микроскопско наблюдение той се вижда тъмен. Когато обаче хетерохроматинът реплицира своята ДНК, той се разхлабва и заприличва на еухроматина.
Макар че “висшите нива” на опаковка на хроматина все още се изясняват, изглежда почти сигурно, че бримките на всяка хроматида се подреждат спирално около ос от нехистонови белтъци. Тя се скъсява все повече, докато хромозомата се уплътни максимално през метафазата. След това отново започва разхлабване. Оста често се нарича хромозомен скелет. По белтъчен състав тя прилича на интерфазния ядрен матрикс, но има и разлики. Снимки на хромозоми, хромозомни скелети и ядрен матрикс могат да се видят например на http://www.csc.fi/jpr/emt/engelhar/Doc/Dis-ResII.html.
Терминът "хромозома" се употребява в три значения. Първоначално той е въведен за късите и дебели нишки, наблюдавани през митозата и мейозата. По-късно е установено, че хромозомите съответстват на интерфазния хроматин и са изградени от ДНК и белтъци. Тогава хромозоми са наречени нуклеопротеиновите единици на хроматина независимо дали са видими (при деленето) или са с размити очертания в интерфазното ядро. Оставало е да се изясни колко молекули ДНК има в една хромозома. Оказва се, че през по-голямата част от живота на клетката хромозомата се състои от 1 молекула ДНК, а при подготовката за делене те стават 2 – по една за всяка хроматида. В редки случаи след многократно удвояване на ДНК се получават хромозоми от повече нишки – явление, наречено политения. След тези данни молекулите ДНК започват също да се наричат хромозоми. Подтекстът определя дали под хромозома се има предвид молекула еукариотна ядрена ДНК, комплексът на тази молекула с белтъци или същият комплекс при условие, че е уплътнен за делене. Можем обаче да въведем и определение, валидно за всички еукариотни хромозоми и дори за бактериалните хромозоми. Хромозомата е част от наследствения материал на клетката, която, ако бъде преместена, се движи като цяло. С други думи, хромозомата е единица за сегрегация.
Хромозомите обикновено се изучават в метафаза, защото тогава са най-уплътнени и добре разграничени. Търсят се клетки в метафаза, залепнали за стъклото с единия си полюс, така че наблюдателят да гледа откъм другия полюс и да вижда всяка хромозома отделно. Тази картина се нарича метафазна пластинка.
Всяка метафазна хромозома се състои от 2 хроматиди. Те са все още видимо свързани в областта на центромерата – ДНК-участъка, с който се закачат за делителното вретено. Под микроскоп този участък се вижда стеснен и е наречен от ранните наблюдатели първично прищъпване.
Центромерата разделя напречно всяка хромозома (съответно хроматида) на две части, наречени рамена. Според положението на центромерата, т.е. според относителната дължина на двете рамена, хромозомите се разделят на 3 групи: (1) метацентрични – с центромера по средата и еднакво дълги рамена; (2) субметацентрични – с донякъде изместена към единия край центромера; двете рамена са различно дълги, но все пак разликата не е твърде голяма; (3) акроцентрични – със силно изместена към единия край центромера, така че едното рамо е съвсем късо. За изчерпателност следва да споменем и телоцентричните хромозоми, които имат само едно рамо, защото центромерата е в самия им край. Истински телоцентрични хромозоми не се срещат в нормалния хромозомен набор, а са резултат от скъсване на някоя хромозома в областта на центромерата или непосредствено до нея. Някои автори обаче наричат “телоцентрични” хромозомите, които просто са силно акроцентрични.
Тъй като ДНК в ядрото е линейна, през метафазата всяка хромозома има 4 свободни края. Крайните участъци на хромозомата се наричат теломери. Трябва да се отбележи, че линейни молекули ДНК не могат да се получат от примитивните пръстенни молекули чрез просто разкъсване. Случайно получените краища са неустойчиви, защото са твърде реактивоспособни. Склонни са да се свързват както помежду си, така и с други молекули. Истинските теломери обаче са стабилни. По-нататък ще стане ясно защо.
Някои хромозоми имат още едно прищъпване освен това на центромерата. Установено е, че в това вторично прищъпване са разположени гените за големите рибозомни РНК. Заетият от тях участък ДНК се нарича нуклеоларен (ядърцев) организатор, защото около тези участъци към края на митозата се образува ядърцето.
Описанието на хромозомния набор на даден вид се нарича кариотип. От фигурата се вижда, че различните организми "опаковат" своята ДНК в хромозоми по различен начин. Тези препарати са получени от диплоидни клетки. Всъщност следва да се има предвид, че почти всички еукариоти в своето индивидуално развитие сменят диплоидна и хаплоидна фаза.
Метафазни пластинки от: А – мишка Mus musculus, 2n = 40. Снимката е любезно предоставена от Петя Нинова от Института по молекулярна биология. Б – дива люцерна Medicago sativa ssp. coerulea, 2n = 16. От Bauchan (2003) с любезното му разрешение. В – папрат четинест многоредник Polyctichum setiferum, 2n = 82. Снимката е любезно предоставена от Даниела Иванова от Института по ботаника.
Броят на хромозомите доста варира. Ако като при прокариотите целият геном се събере в една-единствена хромозома, това отговаря на една двойка в диплоидните клетки. Поне един вид – конската глистя Parascaris univalens, наистина има такъв най-малък възможен брой хромозоми (2n = 2, n = 1). Максималният възможен брой хромозоми е по-трудно да се определи, но явно зависи от това с колко хромозоми може успешно да се справи делителното вретено при митоза и мейоза. Най-големият диплоиден брой хромозоми, установен засега при действителен организъм, е около 1260 – при папратта Ophioglossum reticulatum от Индия. Обикновено 2n е между 10 и 100. Човекът със своите 46 хромозоми влиза в този типичен обхват.
Когато хромозомите са оцветени равномерно като на горните снимки, трудно е да се намират участъци по дължината им, а понякога дори не е ясно коя хромозома коя е. Разработени са методи за диференциално оцветяване, което очертава върху всяка хромозома характернисамо за нея ивици. Тогава е лесно да се търсят области по хромозомата и няма опасност тя да се сбърка с нехомоложна хромозома, дори и ако размерите и формата им са еднакви. Най-разпространеният метод за диференциално оцветяване е G-оцветяването, означавано така заради багрилото Гимза. На долната фигура се виждат човешки хромозоми, оцветени по този начин, изрязани от микроскопската снимка и подредени според общоприети правила. Такава редица от хромозоми се нарича кариограма.
G-оцветени хромозоми на изследван пациент. Установен е нормален мъжки кариотип. Кариограмата е любезно предоставена от З. Маркова от Генетичния център в Смиттаун, САЩ.
Има начини същите ивици, които при G-оцветяването са тъмни, да се видят светли или флуоресциращи. Освен това може да се оцветят специфичните участъци – центромерите, теломерите или нуклеоларните организатори. Диференциалното оцветяване се основава на разлики във физико-химичните свойства на различните хромозомни участъци, дължащи се най-вече на различния им нуклеотиден състав. Например при G-оцветяване тъмни излизат областите с по-високо съдържание на А+Т, а светли – тези с повече Г+Ц. При картирането на гени повечето се падат в светлите G-ивици, но има и в тъмните. Разликата в свойствата, изглежда, се основава на различния брой водородни връзки (2 при А+Т срещу 3 при Г+Ц).
Впрочем въпросът за мястото на гените в хромозомите (т.е. как функцията на хроматина е отразена в структурата на митотичните хромозоми) по-рано е бил доста неудобен. С обикновените микроскопски методи в интерфазния хроматин не се виждат хромозоми. От друга страна, митотичната хромозома не се презаписва и е уплътнена до непроницаемост. Тя се вижда, но за нея е трудно да се каже нещо повече. Нещата са били улеснени от откриването на два особени типа хромозоми, които се отличават с много големи размери и с това, че съчетават добре видима форма с транскрипционна активност.
Хромозомите тип "лампови четки" се образуват през овогенезата на редица животни, но най-добре се наблюдават при земноводните. Овоцитите им встъпват в мейоза
по обичайния начин, хромозомите в ядрото добиват ясни очертания и се сдвояват (всяка с хомоложната си). Малко след прекръстосването мейозата спира и се задържа в профаза I за няколко седмици. Хромозомите силно се удължават и пускат встрани тънки бримки, видими със светлинен микроскоп. Тези бримки са участъци от ДНК, разгънати, за да могат да се презаписват. Синтезираната върху тях РНК е необходима за нарастването на клетката. Цялата хромозома прилича на четка за шишета. С подобни четки са били почиствани стъклата на газените лампи, оттам и името на хромозомите.
“Лампови четки” в овоцит на тритон Triturus viridescens. А. Хомоложна двойка, наблюдавана с фазово-контрастен микроскоп. Отсечката е 0.1 mm. Снимката е любезно предоставена от Joseph Gall от Карнегиевия институт. Б. Пояснителна схема. Това, че всяка хромозома е съставена от 2 хроматиди, не се вижда на снимката.
Другият тип “специални” хромозоми са т. нар. гигантски политенни хромозоми, характерни за ларвите на плодовата мушица Drosophila и други двукрили насекоми. Те се наблюдават най-лесно в слюнните жлези, но присъстват и в останалите тъкани на ларвата. Образуват се, като ДНК се реплицира много пъти, без клетката да навлезе в делене. Многото еднакви нуклеопротеинови нишки се подреждат надлъжно една до друга. Резултатът са политенни (гр. многонишкови) хромозоми. Хомолозите също застават плътно един до друг, така че при Drosophila виждаме само 4 гигантски хромозоми при диплоиден брой 8. Макар че клетката е в интерфаза и дори вече е неспособна да навлезе в митоза, хромозомите са добре очертани и разграничени една от друга. Всяка от тях е нашарена с напречни тъмни дискове и светли междудискови области. Те не трябва да се бъркат с G-ивиците: много по-фини са и се появяват "сами", без да се използват методите за диференциално оцветяване.
Гигантски хромозоми от Drosophila melanogaster (женска). С L и R са означени рамената на съответната хромозома. От Kaufmann (1939).
Като се подреждат успоредно, молекулите ДНК се опъват много повече, отколкото в митотичните хромозоми. Затова и политенните хромозоми са много по-дълги. Рехавият им строеж личи добре при електронномикроскопско наблюдение. Също така се вижда, че хроматиновата нишка е много по-уплътнена в дисковете, отколкото между тях. Затова на дисковете (тъмните участъци) се пада по-голямата част от ДНК и гените.
На горната снимка политенните хромозоми се виждат свободни, без обвивка, защото при приготвянето на препаратите ядрото е разрушено. Иначе in vivo те са затворени в ядрото.
Някои участъци от политенните хромозоми са издути и светли. Наричат се пуфи. В тях хроматиновите нишки са разгънати и се подават настрани като бримки. В хода на ларвното развитие различни пуфи се раздуват и прибират обратно в определен ред, както може да се види на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell.figgrp.1643.
Наблюдавайки пуфите, изследователите са предположили, че там хроматинът се разгъва, за да може да се презаписва. Хипотезата е проверена чрез авторадиография – най-често използваният метод на белязаните атоми. За целта клетката се потапя в среда с радиоактивно белязан предшественик на РНК ([3H]-уридин). След известно време се прави препарат и се покрива със слой фотоемулсия. Разпадайки се, радиоактивните ядра облъчват фотоемулсията и в нея се образуват зърна от елементарно сребро. Те се виждат под микроскоп и така се разбира къде е отишъл белегът (радиоактивният уридин).
Принцип на авторадиографията. От Марков (1984) с малки изменения.
Авторадиограма на част от гигантска хромозома с пуфа е дадена на http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bv.fcgi?tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=puff&rid=cell.figgrp.1644. Вижда се, че най-много черни точки има върху пуфата, следователно именно там се синтезира РНК.
Макар че гигантските хромозоми са изключение, много от сведенията за тях са били потвърдени при обикновените хромозоми. Например във всички хромозоми гените заемат точно определени места, наречени локуси, които са подредени един след друг (линейно). Местата на гените първоначално са установявани чрез методите на класическата генетика: прави се серия кръстосвания, като се следи с кои познати гени е скачен "нашият" изследван ген. Сега локусът може да се намери и по друг начин, стига човек да има поне част от гена намножена "отстрани". Тази част се използва като сонда. Както знаем, сонда се нарича нещо, което се вкарва в обекта, за да се свърже там с нещо друго. Първо сондата трябва да се бележи. Може да се използват радиоактивни изотопи и да се проведе авторадиография. Предпочита се обаче по-безопасно белязване, например с флуорохроми.
И така, правим препарат, който да съдържа клетки в метафаза. Денатурираме ДНК (обработваме я така, че двете вериги да се разделят). Денатурираме и сондата. Накапваме сондата върху препарата. Създаваме условия комплементарните вериги да се сдвоят – процес, наречен хибридизация. Ако сондата намери комплементарно място върху хромозомата, ще се свърже и ще остане там. При флуоресцентна микроскопия генът, който търсим, ще се види като светещо петно. Методът се нарича хибридизация in situ ("на място" – защото хромозомата е горе-долу в нормалния си вид). Когато белегът е флуорохром, това се означава като FISH (англ. съкратено от fluorescent in situ hybridization).
В обяснението ставаше дума за ген, но нищо не пречи с хибридизация in situ да се търсят и други (некодиращи) ДНК-последователности, например от центромерата или теломерата.
FISH със сонди за центромерни последователности. А. Реакция на сонди за Х- и Y-хромозомата, белязани съответно със зелен и червен флуорохром, с метафазна пластинка от човешки лимфоцит. ДНК като цяло е оцветена със син флуорохром. Б. Реакция на сонда за последователност, обща за хромозоми 1, 5 и 19, с метафазна пластинка от човешки овоцит. Сондата е белязана със зелен флуорохром, а ДНК като цяло е оцветена с червен. Снимките са любезно предоставени: А – от Стефка Делимитрева, Б – от Ралица Живкова от катедра Биология на Медицинския университет – София.
Освен това методът позволява да се изследват гени и хромозоми във вида, в който са в интерфазното ядро. Така може да се види например с какви хромозоми разполага дадена неделяща се клетка.
FISH върху интерфазна клетка от човешки ранен зародиш със сонда за центромерна последователност от Х-хромозомата. Сондата е белязана със зелен флуорохром, а ДНК като цяло е оцветена с червен. Отсечката е 10 микрометра. Снимката е любезно предоставена от Стефка Делимитрева от катедра Биология на Медицинския университет – София.
Освен това става възможно да се провери как са подредени хромозомите през интерфазата. Отдавна се е предполагало, че те не заемат случайни места в ядрото. Доскоро обаче е било известно само, че нуклеоларните организатори обикновено се събират заедно в едно ядърце, а под ядрената обвивка има хетерохроматин. Опитите с FISH показват, че хромозомите наистина са подредени в интерфазното ядро по начин, свойствен на дадената тъкан. Обща особеност е, че теломерите са в периферията на ядрото, където вероятно се свързват с ядрената ламина. На тях отговаря периферният хетерохроматин, забелязан при по-ранните изследвания. В някои клетки под ядрената ламина се разполага и центромерният хетерохроматин. В подредбата на останалите части на интерфазните хромозоми вероятно участва нуклеоскелетът.
Както се знае от гигантските хромозоми, РНК се синтезира върху разгънати ДНК-участъци. Затова не е учудващо, че хетерохроматинът не се транскрибира. Той бива 2 вида: структурен (конститутивен) и факултативен. Факултативният хетерохроматин се състои от такива хромозомни участъци, които при други обстоятелства могат да се видят като еухроматин. Факултативният хетерохроматин може да съдържа гени, но те са неизползваеми, "изключени", и това им състояние не е лесно обратимо. Структурният хетерохроматин изобщо не съдържа гени. Той има друга функция: необходим е за опаковането на ДНК в уплътнени хромозоми през митозата и мейозата. ДНК от структурния хетерохроматин през митозата се открива най-вече в центромерите и теломерите, в по-малка степен от двете страни на нуклеоларния организатор и на други места в хромозомите. За да имат хромозоми с място за свързване с делителното вретено и стабилни краища, еукариотите са принудени да държат ДНК специално за тази цел.
Използваните гени са в еухроматина, но съвсем не целият еухроматин е гени, тъй като в него има много повече ДНК, отколкото е нужна за всички гени на клетката. Удивително е колко малка част от ядрената ДНК е кодираща. Еукариотните гени не съставят оперони, а се разполагат поединично между огромни участъци некодираща ДНК. По-малки такива участъци накъсват самите гени, разполагайки се вътре в тях. При досега изучените видове еукариоти кодиращата ДНК е около и под 10% от генома. Част от останалата ДНК има регулаторна или структурна роля. За голяма част от некодиращата ДНК засега не е установена функция. Това не е учудващо, като се има предвид оскъдността на нашите познания за еукариотния геном. Вероятно много от тези некодиращи области имат функции, които още не сме открили. Допуска се обаче, че част от некодиращата ДНК е безполезна за организма и се предава в поколението просто защото еукариотното ядро не е склонно да се прочиства от излишна ДНК. Така може да се обясни защо близки по своята организация еукариоти силно се различават по размерите на генома си (например опашатите земноводни имат до 40 пъти повече ДНК от бозайниците). Освен това част от некодиращата ДНК еволюира с подозрителна скорост – много по-бързо от кой да е видим белег на организма, като че ли промените й не се ограничават от никакъв естествен отбор.
Отделните последователности ДНК са представени в генома с различен брой копия. По този признак последователностите се делят на 3 групи: уникални, умереноповторени и високоповторени.
Уникална е тази ДНК, която се съдържа в генома в 1 или 2 копия. Тук спадат почти всички гени. По-голямата част от уникалната ДНК обаче не е кодираща. Тя включва участъци за регулация на презаписването и много последователности с неизвестна функция.
Умереноповторената ДНК е в няколко десетки до няколко хиляди екземпляра. Много малка част от нея са гени – за рибозомната РНК и хистоните. Некодиращата умереноповторена ДНК е пръсната из целия геном. За нея не е установена функция. За някои разпръснати умерени повтори обаче се предполага, че са нужни за репликацията.
Високоповторената ДНК се състои от много къси последователности (няколко нуклеотида), повторени стотици хиляди пъти. Тя се нарича още сателитна, като терминът няма нищо общо със сателита на хромозомите с нуклеоларен организатор. Копията от повторената последователност се нареждат плътно едно след друго. Такова разположение се нарича тандемно (англ. tandem "впрегнати един зад друг"). Високоповторената ДНК има структурна роля – изгражда центромерите и теломерите. Там към нея освен хистони се присъединяват и специфични нехистонови белтъци, които разпознават първичната й структура и й помагат да осъществява функцията си.
За да са стабилни, теломерите по необходимост трябва да са изградени от повторена ДНК. Строежът на теломерата е показан опростено на долната рисунка. Двете ДНК-вериги не са подравнени, а 3’-краят е по-дълъг от 5’-края. Теломерата се извива назад като примка. Едноверижната “висулка” се вмъква в двойната спирала, сдвоявайки се с комплементарен по-вътрешен участък. Лесно е да намери такъв участък, доколкото цялата теломера представлява тандемни повторения на една и съща къса последователност (например при човека – ТТАГГГ). Така краят на линейната ДНК-молекула се защитава от разграждане и нежелани химични взаимодействия.
Трябва да се отбележи, че повторите на центромерата са различни от повторите на теломерите. Затова центромерата никога не се разполага в самия край на хромозомата. За един участък от ДНК би било непосилно да служи едновременно като центромера и теломера – двете функции имат различни изисквания към първичната структура.
Като цяло еукариотната ядрена ДНК създава впечатление за излишък, безредие и нестабилност. Поне засега ни е толкова трудно да я разберем, че се удивяваме как се оправя самата клетка. Всъщност еукариотите, които фенотипно изглеждат примитивни (например дрождите), имат сравнително малко некодираща ДНК, макар че все пак са далеч от подредения "като аптека" прокариотен геном. Изглежда, фенотипната еволюция на напредналите еукариоти изисква именно тези особености, които ни озадачават в техния генотип.
2. Извънядрена ДНК
Плазмиди, подобни на прокариотните, сред еукариотите са открити само у дрождите. В еукариотната клетка има други важни носители на цитоплазмена наследственост – митохондриите и хлоропластите. Ще се спрем само на митохондриите, но в по-голямата си част описанието важи и за хлоропластите.
Митохондриалният геном представлява една малка пръстенна молекула. Тя е представена поне с по няколко копия на митохондрия.
Понеже в цитоплазмата има много митохондрии, в една клетка се събират стотици и хиляди молекули митохондриална ДНК. Ето защо от някои добре запазени и не много древни вкаменелости могат да се извлекат парчета митохондриална ДНК, но не и ядрена. Съдебната медицина също понякога разчита на митохондриалната ДНК при идентифициране на останки.
По-голямата част от митохондриалната ДНК е кодираща. В животинската еволюция се забелязва склонност към намаляване на митохондриалния геном. Човешките митохондрии имат около 5 пъти по-малко ДНК от дрождените и я оползотворяват максимално. В тази ДНК почти всеки нуклеотид принадлежи на някой ген, а някои нуклеотиди дори на два гена едновременно, понеже гените се припокриват. Митохондриалните гени се презаписват заедно, вероятно за да не се “хаби” ДНК за последователности, регулиращи транскрипцията. Още не е ясно дали митохондриалната ДНК се “опакова” с белтъци.
При някои организми малки РНК-молекули се пренасят от цитозола в митохондриите, но при бозайниците всички митохондриални РНК се кодират от митохондриални гени. Впрочем тези гени са по-малко, отколкото може да се очаква. Митохондриите на бозайниците имат само 2 вида рРНК и 22 вида тРНК. Карта на човешкия митохондриален геном може да се види например на http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/E/Endosymbiosis.html.
Освен това митохондриалният геном на бозайниците съдържа 13 гена за белтъци. Това са все белтъци, пряко участващи в окислителното фосфорилиране – субединици на АТФ-синтетазата и на ензими от дихателната верига. Всички те функционират в четвъртични комплекси с белтъци, кодирани от ядрото. Субединиците, кодирани от митохондриите, са каталитични, а субединиците, кодирани от ядрото – регулаторни.
Освен тези регулаторни полипептидни вериги митохондриите съдържат още много белтъци, които също се кодират от ядрени гени и се синтезират в цитозола. Вероятно гените им първоначално са били митохондриални, но в хода на еволюцията са се прехвърлили в ядрото. Основанията да се предполага това са сериозни, но няма да бъдат обсъждани тук.
Със своите малки размери и простота геномът на животинските митохондрии не напомня ядрения, нито дори прокариотния, а по-скоро геномите на някои вируси. Но за разлика от вирусите и дори от плазмидите митохондриите нямат никаква автономност. Генетичната им система е изцяло под контрола на ядрото. Тя не само кодира малко белтъци, а и нито един от тях не е оставен да работи самостоятелно.
В този текст “нуклеозома” е наричана структурата,
която в други източници се нарича “нуклеозомна сърцевинна частица” (nucleosome
core particle).
Основни източници
Марков Г. Тайните на клетката. 3. осн.
прераб. изд. Народна просвета, София, 1984.
Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular
Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London,
1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell
Gilbert S.F. Developmental Biology. 6th Edition. Sinauer Associates,
Inc., Sunderland, USA, 2000. [Online] http://www.devbio.com/
Lewin B. Genes. John Wiley & Sons Inc., New York, 1983.
Luger K., A. W. Mader, R. K. Richmond, D. F. Sargent, T. J. Richmond (1997). Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389: 251-260.
Bauchan G. (2003). Description of the difficulties and solutions we are developing. [Online] http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/bauchan/problems.html
Ivanova D. (1997). Reports 831-839. In: Kamari G., F. Felber, F. Garbari (Eds.). Mediterranean chromosome number reports. Flora Medit. 7: 225-235.
Shay J.W. (1999). At the end of the millenium, a view of the end. Nature Genetics 23: 382-383.
Robinow C., E. Kellenberger (1994). The bacterial nucleoid revisited. Microbiological Reviews 58: 211-232. Изд. American Society for Microbiology.
Wallace D.C. (1999). Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283: 1482-1488.
URL http://www.mayamarkov.com/biology/04Organgen2/04Organgen2.htm
Публикувано 2003
Copyright © Майя Маркова